一种慢病毒载体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种慢病毒载体及其应用

【技术实现步骤摘要】
一种慢病毒载体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种慢病毒载体及其应用
。

技术介绍

[0002]单细胞测序技术，一类应用是通过对单个细胞的
RNA
表达谱进行测序分析，依据
RNA
表达谱对群体中的细胞进行归类，挖掘新的细胞亚群及细胞功能相关的分子特征和信号通路；另一类应用，是利用基因组上细胞固有的标签
(
如
SNP)
或者外源导入的标签
(
如
CRISPR
介导的随机基因组切割
)
，将特殊的
DNA
序列和细胞的身份进行一一对应
。
通过单细胞
DNA
测序，在发育和分化过程中，对早期胚胎细胞或干细胞的子代细胞进行谱系追踪，精确描绘细胞的命运图谱
。
综上所述，如需结合单细胞测序的两种主要应用，即细胞亚群特征表达谱鉴定和细胞谱系追踪，则需要同时在单细胞水平获取单细胞的
RNA
和
DNA
信息
。
现阶段，单个细胞中同时提取
RNA
和
DNA
，操作技术难度高，通量低，难以进行大规模的应用
。
但是，一些特殊的细胞，例如
T
细胞，本身
RNA
表达谱中携带序列特异的序列
(
如
Tcellreceptor
，
TCR
序列r/>)。
因此，
T
细胞进行单细胞
RNA
表达谱测序的同时，根据
TCR
的序列信息，可以鉴定每个
T
细胞的身份和对
T
细胞群体进行谱系追踪和细胞命运分析
。
因此，借鉴
T
细胞和
TCR
，开发一种技术，在单细胞水平上，高通量地同时获取单细胞
RNA
表达谱和相应的细胞身份，将进一步推动单细胞测序技术在干细胞和发育生物学领域中的应用
。
但该技术只能应用于表达
TCR
受体的少量特殊细胞，无法实现更广泛的细胞类群谱系的追踪和分析
。
[0003]在造血干细胞中，研究者通过多种技术手段，例如利用转座子技术
(transposon)
和人造
DNA
重组位点技术
(Polylox)
，在单细胞水平上对造血系统的细胞谱系分化进行了跟踪和研究；然而，这些方法，同样是基于
DNA
水平上的标签技术，研究结果有力阐明了体内造血干细胞
/
祖细胞与成熟血细胞之间的谱系关系，但并没能揭示这些干细胞
/
祖细胞的分子特征图谱，或在分化过程中起到关键作用的基因
。
[0004]现有技术中针对单细胞遗传标记的技术主要有以下两种：
[0005]方法一：在细胞基因组中利用
Cre
等重组酶制造随机
DNA
序列
(Polylox)。
在细胞中稳定整合一段包含
loxP
位点的人工序列，通过表达
Cre
酶，可以在每个细胞中产生随机组合的重组序列
。
由于每个细胞中序列的重组过程是随机发生的，因此这段序列可以作为细胞的“身份标识”。
带有相同标识的细胞可以认为来源于共同的祖细胞
。
从而可以实现对细胞分化过程的追踪
。
[0006]方法二：利用
CRISPR/Cas9
系统构建细胞标签序列
。
向稳定整合了一段包含
10
个
gRNA
切割位点的目标序列的细胞中，转入表达
Cas9
蛋白和
gRNA
的载体
。
随后
Cas9
蛋白会在
gRNA
介导下对目标序列进行切割，在细胞非同源重组的末端修复机制的作用下，目的序列切割位点附近会随机引入插入
/
缺失
(Indel)
突变，这些随机产生的序列各不相同，可以作为细胞的标签序列，用于细胞分化轨迹的追踪
。
[0007]现有技术有如下缺点：
[0008]方法一：
Polylox
序列长度通常较长，接近
2kb
，现有二代测序技术很难在一个反应中将目的序列测通
。
序列组装过程容易引入突变，从而影响分析的准确性
。
[0009]方法二：
Cas9
标记技术可能引入大片段的缺失和插入，并存在一定脱靶的风险，从而增加分析的难度
。
[0010]且两种方法产生的标签序列的突变类型相对有限，只能标记有限的细胞类群，并且容易出现不同细胞被相同的标签序列标记的情况，从而对分析结果的准确性产生影响；两种方法产生的标签序列通常位于基因组上，无法实现对细胞转录组和标签序列的同时检测和追踪
。
[0011]因此，亟需开发一种可以大通量实现细胞基因组
DNA
和转录组
RNA
的同时标记的技术
。

技术实现思路

[0012]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一
。
[0013]为此，本专利技术一方面提供一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包括功能元件及骨架元件，所述功能元件的3’
UTR
区域包括
10
‑
30bp
的随机序列
。
[0014]本专利技术提供一种适用于细胞标记的慢病毒载体，利用慢病毒载体上插入的随机序列，及慢病毒载体能插入到被转染的细胞的基因组上并稳定遗传的特征，可以实现大通量细胞基因组
DNA
和转录组
RNA
的同时标记，进而构建分子特征图谱
。
[0015]根据本专利技术的具体实施方式，所述功能元件进一步包括启动子
、
报告基因
、
转录后调控元件
、polyA
信号
。
[0016]根据本专利技术的具体实施方式，所述功能元件的启动子包括选自
EF1
α
、CAG、PGK、Ubc
中的任意一种
。
需要说明的是，本领域已知的任意一种通用的强启动子均适用于本专利技术
。
[0017]根据本专利技术的具体实施方式，所述功能元件的报告基因包括选自绿色荧光蛋白基因
、
红色荧光蛋白基因
、
蓝色荧光蛋白基因
、
β
‑
半乳糖苷酶基因
、
萤火虫荧光素酶基因中的任意一种
。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体包括功能元件及骨架元件，所述功能元件的3’
UTR
区域包括
10
‑
30bp
的随机序列
。2.
根据权利要求1所述的慢病毒载体，其特征在于，所述功能元件进一步包括启动子
、
报告基因
、
转录后调控元件
、polyA
信号；任选地，所述启动子包括选自
EF1
α
、CAG、PGK、Ubc
中的任意一种；任选地，所述报告基因包括选自绿色荧光蛋白基因
、
红色荧光蛋白基因
、
蓝色荧光蛋白基因
、
β
‑
半乳糖苷酶基因
、
萤火虫荧光素酶基因中的任意一种；任选地，所述转录后调控元件包括
WPRE。3.
根据权利要求2所述的慢病毒载体，其特征在于，所述随机序列的长度为
15
‑
30bp
；任选地，所述随机序列的长度为
15
‑
25bp
；任选地，所述随机序列的长度为
20bp
；任选地，所述随机序列的插入位点为所述转录后调控元件及所述
polyA
信号之间
。4.
根据权利要求1所述的慢病毒载体，其特征在于，所述骨架元件包括5’
LTR、RRE、cPPT
和3’
LRT
；任选地，所述5’
LTR
的
U3
区...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘超，欧阳文杰，董国艺，刘龙奇，
申请(专利权)人：深圳市禾沐基因生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：