一种弹状病毒包膜蛋白、含其的靶向慢病毒载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种弹状病毒包膜蛋白、含其的靶向慢病毒载体及其应用。所述弹状病毒包膜蛋白包括如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列。包膜蛋白组合包含所述的弹状病毒包膜蛋白；以及靶向蛋白，所述靶向蛋白依次由以下元件组成：跨膜结构域、接头序列和单链抗体。重组慢病毒载体包含所述的包膜蛋白组合。本发明专利技术的重组慢病毒载体有效提高了针对人CD34+造血干细胞的转导效率和特异性，为将来体内递送奠定基础，增加了安全性的同时极大的降低了治疗成本，具有较大的实用价值。具有较大的实用价值。具有较大的实用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种弹状病毒包膜蛋白、含其的靶向慢病毒载体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物技术及生物医学
，尤其涉及一种弹状病毒包膜蛋白、含其的靶向慢病毒载体、制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]无论在基础科研还是临床研究中，基因治疗已经在众多方向上展现出广泛应用前景。作为基因治疗系统的组成部分之一，递送平台负责保护核酸序列不被过度消耗并递送至适当位置发挥功能。而病毒介导的基因递送系统是利用病毒载体将核酸注入宿主细胞的能力来实现递送。这类载体包括逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒等，它们相较于其野生型病毒缺少了与自身复制相关的基因以保障其应用时的安全性。在递送途径上，它们包含离体递送和体内递送两种类型。在离体递送系统中，需先将目标组织细胞从机体中分离培养，再进行遗传物质的植入。在体内递送系统中，遗传物质直接转移到目标组织中，这意味着可以省略繁多的体外操作步骤。为了实现这一目标，病毒表面包膜蛋白需要具备极高的靶向性，否则它们在进入机体后很快会被消耗殆尽。水疱性口炎病毒（VSV）是弹状病毒科的一种包膜病毒。其表面的包膜糖蛋白VSV
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G是病毒附着和进入宿主细胞的决定因素，包含约500个氨基酸，通过三聚体的形式存在于成熟病毒颗粒的表面。这种形式的蛋白质使病毒能够借助普遍表达的低密度脂蛋白受体（LDL
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R）进入宿主细胞内，因此被广泛应用于病毒载体的假型化以实现基因递送。近年来，许多研究者致力于改变病毒载体的趋向性，已有研究针对VSV
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G识别LDL
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R的拓扑结构进行晶体解构，希望在保持其融合能力完整性的基础上影响二者的结合，以便根据需求来实现针对特定细胞的受体进行靶向递送，这对促进基因治疗在临床上的广泛应用有着重要意义。
[0003]水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV
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G)已成为生物医学应用最通用的假型化病毒包膜蛋白类型之一，作为I型跨膜糖蛋白通过N端的胞外受体结合域识别其天然受体，即低密度脂蛋白受体（LDL
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R）。针对VSV
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G的第8、47、209、354号氨基酸进行突变（H8A、K47Q、Y209A和R354A）能够在一定程度上消除其对LDL
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R受体的亲和力，但研究中也发现即便对该4个位点的氨基酸同时进行突变，仍然会保留较低水平的结合（[1] Nikolic J, et al. Nat Commun. 2018; [2] Dobson CS, et al. Nat Methods. 2022; [3] Yu B, et al. Cell. 2022）。在面临细胞数量庞大的体内环境时这将展现出一定的脱靶情况，因此亟待更为有效的手段破坏其天然受体的结合。
[0004]由于其广泛的细胞嗜性，VSV
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G支持将基因高效递送到大部分细胞类型中，例如神经元、骨髓干细胞、胰岛素肿瘤细胞等，但现有的野生型VSV
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G仍然面临着一系列新的挑战：（1）野生型VSV
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G假型化载体无法实现针对混合细胞中的特定细胞进行靶向递送，（2）现有突变体方案仍然会保留较低水平的脱靶，无法展现较高的水平特异性。因此亟须一种提高靶向载体在基因递送时的特异性产品或方法。

技术实现思路

[0005]为解决现有技术中缺乏具有高特异性的靶向载体或靶向递送方法的问题，本专利技术提供了一种包膜蛋白、含其的靶向慢病毒载体及制备方法和应用。
[0006]本专利技术的技术方案之一为提供了一种弹状病毒包膜蛋白，其中，所述弹状病毒包膜蛋白包括如SEQ ID NO: 1或2 所示的氨基酸序列。
[0007]在一些优选的实施例中，所述的弹状病毒包膜蛋白还包括信号肽，所述信号肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 3或4所示。
[0008]本专利技术的技术方案之二为提供了一种多核苷酸，其中，其编码如技术方案之一所述的弹状病毒包膜蛋白。
[0009]在一些优选的实施例中，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 6或7所示。
[0010]本专利技术的技术方案之三为提供了一种膜融合蛋白质粒，其中，其包含如技术方案之二所述的多核苷酸。
[0011]在一些优选的实施例中，所述膜融合蛋白质粒还包含巨细胞病毒增强子、巨细胞病毒启动子、人β
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珠蛋白内含子、科扎克共有序列和/或人β
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珠蛋白多聚腺苷酸化信号；和/或，所述膜融合蛋白质粒的质粒骨架为pMD2.G。其中巨细胞病毒增强子、巨细胞病毒启动子、人β
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珠蛋白内含子、科扎克共有序列和/或人β
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珠蛋白多聚腺苷酸化信号可以为常用质粒pMD2.G（Addgene，编号：12259，https://www.addgene.org/12259/）的元件。
[0012]本专利技术的技术方案之四为提供了一种包膜蛋白组合，其中，其包含如技术方案之一所述的弹状病毒包膜蛋白；以及靶向蛋白，所述靶向蛋白依次由以下元件组成：跨膜结构域、接头序列和单链抗体。
[0013]优选地，所述跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5或10所示；
[0014]和/或，所述接头序列为（G4S）3；
[0015]和/或，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示。
[0016]本专利技术的技术方案之五为提供了一种包膜蛋白质粒，其中，其包含如技术方案之三所述的膜融合蛋白质粒，还包括靶向蛋白质粒；
[0017]其中，所述靶向蛋白质粒中编码跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示；和/或，所述靶向蛋白质粒中编码接头序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 13所示；和/或，所述靶向蛋白质粒中编码单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO: 15所示。
[0018]任选地，所述靶向蛋白质粒还包含巨细胞病毒增强子、巨细胞病毒启动子、人β
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珠蛋白内含子、科扎克共有序列和/或人β
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珠蛋白多聚腺苷酸化信号。其中巨细胞病毒增强子、巨细胞病毒启动子、人β
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珠蛋白内含子、科扎克共有序列和/或人β
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珠蛋白多聚腺苷酸化信号可以为常用质粒pMD2.G的元件。
[0019]在一些优选的实施例中，所述膜融合蛋白质粒和靶向蛋白质粒位于同一质粒上或分别位于不同质粒上；和/或，所述包膜蛋白质粒采用的骨架载体为pMD2.G。
[0020]本专利技术的技术方案之六为提供了一种慢病毒载体包装系统，其中，所述慢病毒载体包装系统包含如技术方案之五所述的包膜蛋白质粒；以及辅助包装质粒和/或穿梭载体质粒；其中，所述辅助包装质粒为psPAX2，所述穿梭载体质粒为pCDH。
[0021]优选地，所述辅助包装质粒、所述穿梭载体质粒、所述膜融合蛋白质粒和靶向蛋白质粒的质量比为(3
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1):(6
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1):(3
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1):本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种弹状病毒包膜蛋白，其特征在于，所述弹状病毒包膜蛋白包括如SEQ ID NO: 1或2所示的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的弹状病毒包膜蛋白，其特征在于，其还包括信号肽，所述信号肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 3或4所示。3.一种多核苷酸，其特征在于，其编码如权利要求1或2所述的弹状病毒包膜蛋白。4. 如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 6或7所示。5.一种膜融合蛋白质粒，其特征在于，其包含如权利要求3或4所述的多核苷酸。6.如权利要求5所述的膜融合蛋白质粒，其特征在于，所述膜融合蛋白质粒还包含巨细胞病毒增强子、巨细胞病毒启动子、人β
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珠蛋白内含子、科扎克共有序列和/或人β
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珠蛋白多聚腺苷酸化信号；和/或，所述膜融合蛋白质粒的质粒骨架为pMD2.G。7.一种包膜蛋白组合，其特征在于，其包含如权利要求1或2所述的弹状病毒包膜蛋白；以及靶向蛋白，所述靶向蛋白依次由以下元件组成：跨膜结构域、接头序列和单链抗体。8.如权利要求7所述的包膜蛋白组合，其特征在于，所述跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5或10所示；和/或，所述接头序列的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示；和/或，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示。9.一种包膜蛋白质粒，其特征在于，其包含如权利要求5或6所述的膜融合蛋白质粒，还包括靶向蛋白质粒；其中，所述靶向蛋白质粒中编码跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示；和/或，所述靶向蛋白质粒中编码接头序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 13所示；和/或，所述靶向蛋白质粒中编码单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO: 15所示。10.如权利要求9所述的包膜蛋白质粒，其特征在于，所述靶向蛋白质粒还包含巨细胞病毒增强子、巨细胞病毒启动子、人β
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珠蛋白内含子、科扎克共有序列和/或人β
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珠蛋白多聚腺苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊业城，张婷婷，欧阳文杰，刘超，顾颖，
申请(专利权)人：深圳市禾沐基因生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：