基于质谱法定量检测狂犬病疫苗中G蛋白含量的多肽序列及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于质谱法定量检测狂犬病疫苗中G蛋白含量的多肽序列，包括10个可重复检测的狂犬病病毒G蛋白的特异性多肽序列组。本发明专利技术还公开了将该多肽序列用于采用质谱法定量检测狂犬病疫苗中G蛋白含量的方法，该方法首先筛选出样品中G蛋白特异性的多肽序列，采用相应的重标定量肽、狂犬病病毒G蛋白、或包含相应肽段序列的灭活狂犬病病毒样本进行系列稀释作为标准品，绘制标准曲线，利用质谱仪的平行反应监测技术，对预设目标肽段的检测信号进行分析，从而实现狂犬病病毒G蛋白的定量检测。该方法具有可扩展性，且灵敏度高、特异性强、不依赖于抗体、可定量检测，能够应用于狂犬病疫苗原液、成品的含量测定与质量评估。成品的含量测定与质量评估。成品的含量测定与质量评估。

【技术实现步骤摘要】
基于质谱法定量检测狂犬病疫苗中G蛋白含量的多肽序列及其应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种基于质谱法定量检测狂犬病疫苗中G蛋白含量的多肽序列及其应用。

技术介绍

[0002]狂犬病病毒抗原含量是狂犬病疫苗的主要质量指标之一，其中糖蛋白(G蛋白)是狂犬病毒唯一能诱导宿主产生中和抗体并与之结合的蛋白。狂犬病疫苗的保护效价主要由G蛋白起作用，一定程度上可以认为疫苗中G蛋白含量的高低决定了疫苗的保护效价。由于小鼠法效价测定反映的是疫苗的体内生物活性，EIA方法能检测出产品中糖蛋白抗原相对含量，两种检测方法的结果在病毒抗原生物活性良好的条件下呈正相关性。因此，当前国内狂犬病疫苗的研制和生产中普遍采用小鼠法和EIA方法，对疫苗的有效成分进行质量控制。
[0003]小鼠法包括病毒滴度测定、NIH法效力测定等，其试验周期需要14～28天、实验动物的使用有严格的伦理制约、试验结果易受动物个体差异等不可控因素影响，因此该类方法测定结果稳定性差，存在明显的局限性。
[0004]EIA方法是利用抗狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体与G蛋白抗原特异结合的特点建立的检测方法，包括单向辐射状免疫扩散试验(SRD)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和时间分辨免疫荧光分析(TRFIA)等。相比小鼠法，EIA方法相对简便、快速、特异性强，且具有可相对定量检测等优点；但该类方法同样存在诸多缺点：
[0005](1)抗体特异性无法覆盖狂犬病毒株，通常只能检测特定病毒株；
[0006](2)抗原
‑r/>抗体结合反应对试验条件要求苛刻，常需精确控制反应温度、时间；
[0007](3)测定结果受缓冲液及样品组成成分影响，样品非抗原成分变化常导致试验发生偏离，无法准确评估工艺开发过程的抗原含量。
[0008]因此，结合上述情况，基于质谱分析的蛋白质平行反应监测(PRM)定量技术，具有高灵敏度、高特异性、不依赖于抗体、可定量等特点，有望克服上述EIA方法的缺点，开发用于测定狂犬病病毒G蛋白含量的定量检测方法具有重要意义，该方法有望成为区别于EIA原理的新一代质控技术。

技术实现思路

[0009]针对现有技术的不足，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种基于质谱法定量检测狂犬病疫苗中G蛋白含量的多肽序列，将其应用于质谱法定量检测狂犬病疫苗中G蛋白含量，能够提高狂犬病疫苗的质控水平。
[0010]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种基于质谱法定量检测狂犬病疫苗中G蛋白含量的多肽序列，包括10个可重复检测的狂犬病病毒G蛋白的特异性多肽序列组，其氨基酸序列如下：
[0011](1)VGYISAIK；
[0012](2)YEESLHNPYPDYH；
[0013](3)TTKESLIIISPSVTDLDPYDK；
[0014](4)ESLIIISPSVTDLDPYDK；
[0015](5)LMDGTWVAMQTSDETK；
[0016](6)SDEIEHLVVEELVK；
[0017](7)LVPGFGK；
[0018](8)TWNEIIPSK；
[0019](9)MHPLADPSTVFK；
[0020](10)EGDEAEDFVEVHLPDVYK。
[0021]未来得到上述多肽序列，本专利技术提供了一种多肽序列的筛选方法，包括如下步骤：
[0022](1)已灭活狂犬病病毒样本FASP酶解；
[0023](2)LC
‑
MS/MS(DDA实验)，采用软件进行数据分析，筛选重复出现、且质谱信号响应好的肽段，选定17个多肽序列；
[0024](4)LC
‑
MS/MS(PRM实验)；筛选特异性好、可重复出现的狂犬病病毒G蛋白的多肽序列，将上述筛选到的17个肽段序列信息导入软件中进行PRM方法设置，狂犬病病毒G蛋白标准品取0.5μg肽段进行色谱分离；分离后的肽段直接进入质谱仪Thermo Scientific Q Exactive进行PRM质谱检测；采用软件进行RPM实验数据分析，扣除背景、筛选出质谱信号响应好的肽段，最终得到如权利要求1中所述的10个多肽序列。
[0025]其中，所述步骤(1)中已灭活狂犬病病毒样本FASP酶解包括如下具体步骤：
[0026](1)取3个不同批次含已灭活狂犬病病毒的样本：加入TCEP置60℃反应1小时，加入MMTS室温45分钟进行还原烷基化；
[0027](2)将还原烷基化后的蛋白溶液加至10K超滤管中，4℃12000g离心20min；
[0028](3)加入8M尿素(pH 8.5)，4℃12000g离心20min，弃废液，重复2次；
[0029](4)加入0.25M TEAB，4℃12000g离心20min，弃废液，重复3次；
[0030](5)更换新的收集管，加入0.5M TEAB、胰蛋白酶(胰蛋白酶与蛋白质量比1:50)，37℃过夜；
[0031](6)次日加入胰蛋白酶(胰蛋白酶与蛋白质量比1:100)，37℃反应4小时；12000g离心20min；
[0032](7)酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；向超滤管中加入0.5M TEAB，4℃12000g离心20min，收集管底部溶液与上步合并，得到酶解后的样品；
[0033](8)将酶解后的样品真空抽干，以便进行下一步实验。
[0034]另外，为了提高狂犬病疫苗的质控水平，本专利技术还提供了一种基于质谱法定量检测狂犬病疫苗中G蛋白含量的方法，该方法选择所述的多肽序列为目标序列，采用狂犬病病毒G蛋白或灭活狂犬病病毒样本进行系列稀释作为标准品，采集目标序列的质谱信号，以“狂犬病病毒G蛋白浓度/含量
‑
目标序列的质谱信号”建立坐标系，拟合线性回归方程，实现狂犬病病毒G蛋白的含量测定。
[0035]优选地，该方法中采用权利要求1中所述的多肽序列，制备重标定量肽作为内标物加至待测样本中，实现狂犬病病毒G蛋白含量的准确定量。
[0036]优选地，该方法包括如下具体步骤：
[0037](1)样本和标准品的FASP酶解，所述标准品为狂犬病病毒G蛋白或灭活狂犬病病毒样本进行系列稀释所得的标准品；
[0038](2)LC
‑
MS/MS(PRM实验)：将样本和按照梯度稀释的标准品，加至进样杯中进行LC
‑
MS/MS；
[0039](3)实验完成后，对目标多肽序列中离子强度最高的3个二级子离子信号求和作为目标多肽序列的质谱离子强度信号值，将质谱数据导出进行数据分析，以狂犬病病毒G蛋白标准品溶液的浓度为横坐标，质谱离子强度信号值为纵坐标绘制标准曲线，得到线性拟合方程，将待测样本目标多肽序列的质谱离子强度信号值代入上述方程式中，结合样本上机测试溶液的浓度，根据样本预处理过程，计算出待测样本的狂犬病病毒G蛋白含量。
[0040]其中，所述步骤(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于质谱法定量检测狂犬病疫苗中G蛋白含量的多肽序列，包括10个可重复检测的狂犬病病毒G蛋白的特异性多肽序列组，其氨基酸序列如下：(1)VGYISAIK；(2)YEESLHNPYPDYH；(3)TTKESLIIISPSVTDLDPYDK；(4)ESLIIISPSVTDLDPYDK；(5)LMDGTWVAMQTSDETK；(6)SDEIEHLVVEELVK；(7)LVPGFGK；(8)TWNEIIPSK；(9)MHPLADPSTVFK；(10)EGDEAEDFVEVHLPDVYK。2.如权利要求1中所述的多肽序列在定量检测狂犬病疫苗中G蛋白含量的试剂中的应用。3.一种如权利要求1中所述的多肽序列的筛选方法，其特征在于包括如下步骤：(1)已灭活狂犬病病毒样本FASP酶解；(2)LC
‑
MS/MS(DDA实验)，采用软件进行数据分析，筛选重复出现、且质谱信号响应好的肽段，选定17个多肽序列；(4)LC
‑
MS/MS(PRM实验)；筛选特异性好、可重复出现的狂犬病病毒G蛋白的多肽序列，将上述筛选到的17个肽段序列信息导入软件中进行PRM方法设置，狂犬病病毒G蛋白标准品取0.5μg肽段进行色谱分离；分离后的肽段直接进入质谱仪Thermo Scientific Q Exactive进行PRM质谱检测；采用软件进行RPM实验数据分析，扣除背景、筛选出质谱信号响应好的肽段，最终得到如权利要求1中所述的10个多肽序列。4.如权利要求3中所述的多肽序列的筛选方法，其特征在于，所述步骤(1)中已灭活狂犬病病毒样本FASP酶解包括如下具体步骤：(1)取3个不同批次含已灭活狂犬病病毒的样本：加入TCEP置60℃反应1小时，加入MMTS室温45分钟进行还原烷基化；(2)将还原烷基化后的蛋白溶液加至10K超滤管中，4℃12000g离心20min；(3)加入8M尿素(pH 8.5)，4℃12000g离心20min，弃废液，重复2次；(4)加入0.25M TEAB，4℃12000g离心20min，弃废液，重复3次；(5)更换新的收集管，加入0.5M TEAB、胰蛋白酶(胰蛋白酶与蛋白质量比1:50)，37℃过夜；(6)次日加入胰蛋白酶(胰蛋白酶与蛋白质量比1:100)，37℃反应4小时；12000g离心20min；(7)酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；向超滤管中加入0.5MTEAB，4℃12000g离心20min，收集管底部溶液与上步合并，得到酶解后的样品；(8)将酶解后的样品真空抽干，以便进行下一步实验。5.一种基于质谱法定量检测狂犬病疫苗中G蛋白含量的方法，其特征在于：该方法选择如权利要求1中所述的多肽序列为目标序列，采用狂犬病病毒G蛋白或灭活狂犬病病毒样本
进行系列稀释作为标准品，采集目标序列的质谱信号，以“狂犬病病毒G蛋白浓度/含量
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目标序列的质谱信号”建立坐标系，拟合线性回归方程，实现狂犬病病毒G蛋白的含量测定。6.如权利要求5中所述的基于质谱法定量检测狂犬病疫苗中G蛋白含量的方法，其特征在于：该方法中采用权利要求1中所述的多肽序列，制备重标定量肽作为内标物加至待测样本中，实现狂犬病病毒G蛋白含量的准确定量。7.如权利要求5中所述的基于质谱法定量检测狂犬病疫苗...

【专利技术属性】
技术研发人员：何春辉，蒋孝军，方浩霖，周婷，张乐峰，邓微，李晓光，卢嘉怡，游林玉，李结慧，赵起，
申请(专利权)人：广州诺诚生物制品股份有限公司，
类型：发明
国别省市：