一种高密度发酵生产单细胞蛋白的方法技术

本发明专利技术提供一种高密度发酵生产单细胞蛋白的方法，所述方法包括：将解脂耶氏酵母菌种接种于种子培养基中进行种子培养，得到种子液；将所述种子液接种于发酵培养基中进行高密度发酵，所述高密度发酵的过程中补加乙酸和氮源，得到所述单细胞蛋白；所述种子培养基的碳源包括第一乙酸盐，所述发酵培养基的碳源包括第二乙酸盐和/或酮类化合物。本发明专利技术通过特定的物料和工艺相互复配，有效提升了菌体的生长速率和单细胞蛋白的合成速率，使所述方法能够在短时间内实现菌体的高密度发酵和单细胞蛋白的高效合成，在显著缩短高密度发酵的培养时间的同时，能够获得粗蛋白含量更高的发酵产物，极大地提升了单细胞蛋白的生产效率和产量。量。量。

【技术实现步骤摘要】
一种高密度发酵生产单细胞蛋白的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种高密度发酵生产单细胞蛋白的方法。

技术介绍

[0002]目前，随着人口的持续增长，人们对于食品、尤其是肉类的消费需求不断增高，预计到2050年，全球肉类的需求将超过4亿吨。中国作为世界第一的人口大国，食品的需求量也在持续增长，2018年中国肉类消费为8829.6万吨，超过欧盟和美国的总和。在肉类消费增长的同时，饲料需求也在持续扩增，饲料产量超过2.4亿吨。饲料的主要成分以淀粉和蛋白为主，其中蛋白的主要来源是植物性蛋白豆粕和动物性蛋白鱼粉。豆粕是大豆提取豆油后得到的副产品，是棉籽粕、花生粕、菜籽粕等12种动植物油粕饲料产品中产量最大、用途最广的一种。豆粕的产量与大豆的产量相关，但是，中国大豆的自给率不足，大约有85％左右依赖进口，大豆的短缺影响了粮食和蛋白安全，需要其他可用于饲料的资源来进行替代。此外，饲料中动物性蛋白鱼粉的供应量也在持续紧缩，2020年全球鱼粉的消耗量为300万吨，预计到2025年，鱼粉的缺口可能达到100万吨。中国鱼粉年产量约为120万吨，自给率约为40％
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50％。2020年中国鱼粉进口量为142万吨，进口额150亿。除了短缺难题之外，鱼粉的大量生产和过度捕捞也极大地透支了海洋渔业资源，造成鱼类数量和种群量的减少，为生态健康安全带来较大的影响。基于上述考虑，低蛋白饲料、非常规蛋白替代品成为畜牧业关注的重点，其中最为重要和最有潜力的一种蛋白替代就是单细胞蛋白(SCP)。
[0003]单细胞蛋白又称微生物蛋白，它是用许多工农业废料及石油废料人工培养的微生物菌体。单细胞蛋白不是一种纯蛋白质，而是由蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸、非蛋白质的含氮化合物、维生素和无机化合物等混合物组成的细胞质团，化学组成中一般以蛋白质和脂肪为主。
[0004]单细胞蛋白在饲料中的应用大约始于上世纪90年代，利用味精菌渣、酵母菌渣等进行了禽畜、水产、生猪等一系列的动物实验，结果表明，菌体蛋白对于动物健康有一定益处，由此开始了单细胞蛋白在饲料领域的应用。目前，酵母菌在禽畜和水产成品饲料中已经有了较为广泛的应用，大约占所有饲料产量的5％
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10％，水产饲料中单细胞蛋白的占比更大，大约为10％
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20％。随着技术和工艺的发展，乙醇梭菌、甲烷菌蛋白也已经得到开发，这些蛋白虽然有动物实验数据表明其安全性和生物利用度，但是由于技术尚新，目前尚未有添加乙醇梭菌和甲烷菌的饲料产品上市，除此之外，光合细菌和藻类在饲料蛋白上也有一定的应用，但产量比较小，并非主流产品。
[0005]单细胞蛋白通常采用生物发酵技术制备得到，具体包括：在培养液配制和灭菌完成以后，将其和菌种投放到发酵罐中，控制发酵条件，菌种会迅速进行繁殖；发酵完毕，用离心、沉淀等方法收集菌体，最后经过干燥处理，就制成了单细胞蛋白成品。通过合成生物学发酵方法制备单细胞蛋白，能够利用生物转化的方式固定CO2，得到菌体蛋白用于饲料，有利于缓解因较高的肉类需求增长造成的资源短缺，以及鱼粉的过量使用造成的环境污染问题。目前国家正大力推进低蛋白饲料以及非常规蛋白资源，农业和畜牧业的研究人员也在
大力推进单细胞蛋白的推广，单细胞蛋白是未来饲料添加剂领域的一个重要发展方向。但是，目前单细胞蛋白的发酵生产周期长，产量和产能都有明显的不足之处，难以满足规模化的应用需求，因此，开发具有更高效率和更高产量的单细胞蛋白的制备方法，是本领域的研究重点。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种高密度发酵生产单细胞蛋白的方法，通过碳源的设计，采用特定的物料和工艺相互复配，使所述方法能够在短时间内实现菌体的高密度发酵和单细胞蛋白的高效合成，极大地提高了单细胞蛋白的生产效率和产量。
[0007]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]本专利技术提供一种高密度发酵生产单细胞蛋白的方法，所述方法包括：将解脂耶氏酵母菌种接种于种子培养基中进行种子培养，得到种子液；将所述种子液接种于发酵培养基中进行高密度发酵，所述高密度发酵的过程中补加乙酸和氮源，得到所述单细胞蛋白；所述种子培养基的碳源包括第一乙酸盐，所述发酵培养基的碳源包括第二乙酸盐和/或酮类化合物。
[0009]本专利技术以解脂耶氏酵母菌种作为发酵菌种，其为非基因工程菌，比常规菌体更加安全，已被美国食品药品监督管理局FDA认证为一般认可安全的微生物(Generally Recognized as Safe，GRAS)，是理想的食品工业用菌。所述方法对种子培养和高密度发酵中的碳源进行设计，在种子培养基中加入乙酸钠，能够促进菌体形成特有的乙酸代谢途径，为后续的高密度发酵过程中添加乙酸生长更快打下基础；同时，发酵培养基的碳源中也包括乙酸钠，进一步诱导和促进菌体的乙酸代谢途径。所述高密度发酵的过程中补加乙酸和氮源，其中，所述乙酸一方面能够中和发酵过程中产生的碱性物质，使菌体处于最佳的中性pH生长环境，另一方面，乙酸作为碳源，其具有很高的碳含量，能够有效促进菌体的快速生长和单细胞蛋白的合成，而且乙酸无需灭菌处理，可直接添加。进一步地，所述发酵培养基中含有酮类发酵促进剂，在乙酸代谢途径中发挥中间产物的催化功能，促进菌体的快速生长，缩短发酵周期。
[0010]综上所述，本专利技术提供的方法中，通过在种子培养基的碳源中引入第一乙酸盐，诱导和促进菌体生成特有的乙酸代谢途径，为后续高密度发酵过程中添加乙酸作为碳源、促进菌体快速生长奠定基础；同时发酵培养基的碳源包括第二乙酸盐和/或酮类化合物，促进菌体快速生长；在高密度发酵阶段补加氮源和乙酸，在调控菌体处于最优的中性pH生长环境的同时，为菌体补充合适的营养成分以供菌体持续生长，有效提升了菌体的生长速率和单细胞蛋白的合成速率。通过特定的物料和工艺相互复配，使所述方法能够在短时间内实现菌体的高密度发酵和单细胞蛋白的高效合成，在显著缩短高密度发酵的培养时间的同时，能够获得粗蛋白含量更高的发酵产物，极大地提升了单细胞蛋白的生产效率和产量。
[0011]以下作为本专利技术的优选技术方案，但不作为对本专利技术提供的技术方案的限制，通过以下优选的技术方案，可以更好的达到和实现本专利技术的目的和有益效果。
[0012]优选地，所述第一乙酸盐包括乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选乙酸钠。
[0013]优选地，所述种子培养基中第一乙酸盐的质量浓度为5
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15g/L，例如可以为6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L或14g/L等。
[0014]优选地，所述种子培养包括依次进行的一级种子培养和二级种子培养。
[0015]优选地，所述一级种子培养所用的一级种子培养基包括如下组分：第一乙酸盐5
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15g/L，葡萄糖1％
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3％，酵母粉0.6％
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2％，酪蛋白胨1.5％
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高密度发酵生产单细胞蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：将解脂耶氏酵母菌种接种于种子培养基中进行种子培养，得到种子液；将所述种子液接种于发酵培养基中进行高密度发酵，所述高密度发酵的过程中补加乙酸和氮源，得到所述单细胞蛋白；所述种子培养基的碳源包括第一乙酸盐，所述发酵培养基的碳源包括第二乙酸盐和/或酮类化合物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一乙酸盐包括乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵中的任意一种或至少两种的组合，优选乙酸钠；优选地，所述种子培养基中第一乙酸盐的质量浓度为5
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15g/L；优选地，所述种子培养包括依次进行的一级种子培养和二级种子培养；优选地，所述一级种子培养所用的一级种子培养基包括如下组分：第一乙酸盐5
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15g/L，葡萄糖1％
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3％，酵母粉0.6％
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2％，酪蛋白胨1.5％
‑
3.2％；优选地，所述一级种子培养的温度为30
‑
33℃，时间为16
‑
18h；优选地，所述一级种子培养在搅拌条件下进行，所述搅拌的转速为100
‑
300rpm；优选地，所述一级种子培养至OD值为4.2
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6.8，得到一级种子；优选地，所述二级种子培养所用的二级种子培养基包括如下组分：第一乙酸盐5
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20g/L，葡萄糖1％
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3％，酵母粉0.6％
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2％，酪蛋白胨1.5％
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3.2％，硫酸镁0.8％
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2.4％，盐酸硫铵0.2％
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0.8％；优选地，所述二级种子培养基中还包括第一微量元素添加剂，所述第一微量元素添加剂的用量为0.8％
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2.6％；优选地，所述第一微量元素添加剂包括如下组分：硫酸铜4
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8g/L，碘化钠0.12
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0.16g/L，硫酸锰5
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6g/L，钼酸钠0.1
‑
0.2g/L，硼酸0.04
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0.08g/L，氯化钴0.6
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0.8g/L，氯化锌18
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21g/L，硫酸亚铁38
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41g/L，生物素0.3
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0.5g/L，硫酸3
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5.2g/L；优选地，所述一级种子培养得到的一级种子以5％
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10％的接种量接种于二级种子培养基中进行二级种子培养；优选地，所述二级种子培养的通气速度为0.1
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1.3vvm；优选地，所述二级种子培养在搅拌条件下进行，所述搅拌的转速为150
‑
900rpm；优选地，所述二级种子培养的温度为30
‑
33℃，时间为8
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12h；优选地，所述二级种子培养至OD值为12
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16，得到所述种子液。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的碳源包括第二乙酸盐和酮类化合物的组合；优选地，所述第二乙酸盐包括乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选乙酸钠；优选地，所述发酵培养基中第二乙酸盐的质量浓度为5
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15g/L；优选地，所述发酵培养基中酮类化合物的质量百分含量为0.1％
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0.6％；优选地，所述发酵培养基包括如下组分：第二乙酸盐5
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15g/L，葡萄糖1％
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3％，酵母粉0.6％
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2％，酪蛋白胨1.5％
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3.2％，硫酸镁0.8％
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1.2％，盐酸硫铵0.6％
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1.4％，甜菜碱0.5％
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1％，硫酸铵3.5％
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6.8％，磷酸二氢钾5％
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7％，磷酸氢二钠2％
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4％，酮类化合物0.1％
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0.6％；
优选地，所述酮类化合物为C3
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C10酮类化合物；优选地，所述酮类化合物包括丙酮、甲基乙基酮、环己酮中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选丙酮；优选地，所述发酵培养基中还包括第二微量元素添加剂，所述第二微量元素添加剂的用量为0.8％
‑
2.6％；优选地，所述第二微量元素添加剂包括如下组分：硫酸铜4
‑
8g/L，碘化钠0.12
‑
0.16g/L，硫酸锰5
‑
6g/L，钼酸钠0.1
‑
0.2g/L，硼酸0.04
‑
0.08g/L，氯化钴0.6
‑
0.8g/L，氯化锌18
‑
21g/L，硫酸亚铁38
‑
41g/L，生物素0.3
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0.5g/L，硫酸3
‑
5.2g/L。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的方法，其特征在于，所述种子液以3％
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6％的接种量接种于发酵培养基中进行高密度发酵；优选地，所述高密度发酵的过程中补加的氮源，包括尿素、硫酸铵、硝酸铵、氨水中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选尿素。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的方法，其特征在于，所述高密度发酵的温度为27
‑
33℃，优选28
‑
32℃；优选地，所述高密度发酵的pH值为6.4
‑
7.1，进一步优选6.5
‑
7；优选地，所述高密度发酵在搅拌条件下进行，所述搅拌的转速为130
‑
800rpm；优选地，所述高密度发酵的通气速度为0.5
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2.4vvm；优选地，所述高密度发酵至OD值为780
‑
820，结束发酵，得到所述单细胞蛋白。6.根据权利要求1
‑
5任一项所述的方法，其特征在于，所述高密度发酵包括OD值依次升高的第一发酵阶段、第二发酵阶段和第三发酵阶段；所述第一发酵阶段的OD值＜500，所述第一发酵阶段中补加乙酸和氮源的碳氮比＞18；所述第二发酵阶段的OD值为500
‑
700，所述第二发酵阶段中补加乙酸和氮源的碳氮比为5
‑
18；所述第三发酵阶段的OD值＞700，所述第三发酵阶段中补加乙酸和氮源的碳氮比＜5。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一发酵阶段包括依次进行的阶段A、阶段B和阶段C；所述阶段A中，OD值＜100，温度为31
‑
33℃，pH值为6.4
‑
6.6，通气速度为0.5
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【专利技术属性】
技术研发人员：王北，马光，潘朝阳，张雅萍，马玲燕，张永振，
申请(专利权)人：万华化学集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：