一种山楂种质鉴定的基因及其鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种山楂种质鉴定的基因及其鉴定方法，一对

【技术实现步骤摘要】
一种山楂种质鉴定的基因及其鉴定方法


[0001]本专利技术涉及一种山楂种质鉴定的方法，尤其涉及一种
LEAFY
基因第1内含子序列进行山楂种质鉴定的方法
。

技术介绍

[0002]山楂属蔷薇科山楂属，是一种独特的果树资源，经济
、
营养价值高，药理作用显著，广泛分布于东亚
、
欧洲
、
北美东部北温带地区
(Phipps
等，
1990
；
Chang
等，
2002
；
Xu
等，
2016)。
山楂作为药用植物在中国有着悠久的历史
。
世界上有
20
多种山楂被用作草药或药材
(Chang
和
But
，
2014)。20
世纪中期，山楂属植物的分组相关研究中，将山楂属植物分为
25
个组
(TALENT
等，
2005)。
中国是山楂属物种
(
包括栽培物种和一些野生物种
)
的主要原产地之一，并且具有悠久的山楂栽培历史
(
郭太君等，
1995)。
我国的山楂属植物，经过长期的选择，形成了丰富的种质资源
。
原产的山楂属植物通常认为是6个组，包括
18
个种和6个变种
(
赵焕谆和丰宝田，
1996)
；也有学者认为，我国的山楂属植物共有
20
种和7个变种
(
董文轩和李作轩，
2015)。
[0003]传统山楂属植物的种类划分基于形态特征和地理分布，广泛存在于山楂属植物中的无融合生殖
、
种间杂交以及多倍化等现象导致其形态学特征发生高度遗传变异
(TALENT
等，
2005)
，同时也造成山楂资源中普遍存在的同物异名和同名异物现象，给山楂属植物的种类划分及资源鉴定带来了较大困难
(Campbell
和
Dickinson
，
1990)。
形态特征是鉴定山楂属物种的重要指标
(Dickinson
等，
1996)。
然而，基于形态特征的山楂传统分类常常存在争议并受到环境的影响
(Christensen
，
1984
；
Gosler
等，
1994)。
因此，开展山楂种质资源的特异性识别技术探索，准确鉴定山楂资源的特异性，可为资源的保存与合理利用提供理论基础
。
[0004]目前，山楂属植物分类主要依靠形态学的研究，依赖于表型的差异
。
然而，表型性状受环境
、
气候
、
人为因素等多种影响，往往提供的信息不够准确
。
且主观判断表型形状，需要丰富的实践经验才能获得较为准确的数据
。
例如，羽裂山楂和羽裂山楂大果变种两者在树形
、
花序等形态相似，必须通过果实的表型性状才能区分
。
伏山楂与羽裂山楂大果变种两者在树形
、
花序
、
叶片
、
果实形态上非常相似，不易区分
。
羽裂山楂大果变种中，由于栽培地及选育者的原因，导致某些栽培品种常存在同物异名或同名异物的现象，给山楂育种工作造成极大困扰
。
[0005]随着分子生物学技术的快速发展，许多分子标记如
AFLP(Amplified fragment length polymorphism)
标记，
RFLP(Restriction fragment lengthpolymorphism)
标记，
RAPD(Random amplification polymorphism)
标记
、DNA
简单重复序列
SSR(Simple sequence repeats)
等，已用于山楂属植物的遗传多样性及分类的研究中
。
然而，上述分子标记的方法均存在一定的缺陷，如技术操作要求高
、
试验成本高
、
重复性不稳定等等
。
特别是在鉴定伏山楂资源方面，由于其多为多倍体的特性，利用上述分子标记，如
SSR、RAPD
标记等无法将其单独区分出来，对伏山楂种质资源鉴定的准确性造成一定影响
。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的上述不足，本专利技术的目的是提供一种用于山楂种质鉴定的基因；进一步，利用
LEAFY
基因第1内含子序列进行山楂种质鉴定的方法，解决目前山楂种质资源鉴定效率不高，准确性不好问题
。
[0007]实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种用于山楂种质鉴定的基因，包括一对
LEAFY
基因第1内含子序列的扩增引物：
[0009]正向引物5’‑
GGATCCRGATGCCTTCTCTGCGAACTTGTTCAAGTGG
‑3’
；
[0010]反向引物5’‑
GTTCTTTTTGCCACGCGCCACCTCCCCCGG
‑3’
。
[0011]进一步，本专利技术提供利用
LEAFY
基因第1内含子序列进行山楂种质鉴定的方法，包括如下步骤：
[0012]利用上述正向
、
反向引物对已知不同种属山楂种质资源进行
PCR
扩增；
[0013]利用上述正向
、
反向引物对未知山楂种质资源进行
PCR
扩增；
[0014]将上述两个步骤获得的扩增序列进行比对分析，构建系统进化树，根据分析结果进行山楂种质资源的鉴定
。
[0015]进一步，采用本专利技术，在利用上述正向引物和反向引物进行
PCR
扩增步骤前，还需提取已知山楂种质资源和未知种质资源的全基因组
DNA。
[0016]进一步，所述提取已知山楂种质资源和未知种质资源的全基因组
DNA
，包括如下步骤：
[0017]步骤1：在
65℃
水浴锅中预热2％
CTAB
提取液和2％
β
‑
疏基乙醇；
[0018]步骤2：取
0.1g
新鲜叶片，加入液氮充分研磨，然后迅速转移至
1.5mL
离心管中，加入预热的
CTAB
提取液
700
μ
l
，
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于山楂种质鉴定的基因，其特征在于，包括一对
LEAFY
基因第1内含子序列的扩增引物：正向引物5’‑
GGATCCRGATGCCTTCTCTGCGAACTTGTTCAAGTGG
‑3’
；反向引物5’‑
GTTCTTTTTGCCACGCGCCACCTCCCCCGG
‑3’
。2.
利用
LEAFY
基因第1内含子序列进行山楂种质鉴定的方法，包括如下步骤：利用上述正向
、
反向引物对已知不同种属山楂种质资源进行
PCR
扩增；利用上述正向
、
反向引物对未知山楂种质资源进行
PCR
扩增；将上述两个步骤获得的扩增序列进行比对分析，构建系统进化树，根据分析结果进行山楂种质资源的鉴定
。3.
根据权利要求2所述利用
LEAFY
基因第1内含子序列进行山楂种质鉴定的方法，其特征在于，在利用上述正向引物和反向引物进行
PCR
扩增步骤前，还需提取已知山楂种质资源和未知种质资源的全基因组
DNA。4.
根据权利要求2所述利用
LEAFY
基因第1内含子序列进行山楂种质鉴定的方法，其特征在于，所述提取已知山楂种质资源和未知种质资源的全基因组
DNA
包括如下步骤：步骤1：在
65℃
水浴锅中预热2％
CTAB
提取液和2％
β
‑
疏基乙醇；步骤2：取
0.1g
新鲜叶片，加入液氮充分研磨，然后迅速转移至
1.5mL
离心管中，加入预热的
CTAB
提取液
700
μ
l
，
65℃
水浴
30min
，期间每隔
10min
轻轻颠倒混匀；步骤3：水浴结束后，取出离心管冷却至室温；
12000rpm
，
4℃
条件下离心
5min
，取上清液
550
μ
L
转入
1.5mL
新离心管；步骤4：加入
600
μ
LV:V
＝
24∶1
的氯仿
/
异戊醇，液氮蒸汽上充分混匀，
12000rpm
，
4℃
离心
5min
，取上清液
350
μ
L
转入
1.5mL
新离心管；步骤5：加入
30
μ
L
的
NaAC
及
770
μ
L
的预冷无水乙醇，混匀
‑
20℃
静置
2h
以上，随后
4℃
，
12000rpm/min
离心
15min。
此步骤肉...

【专利技术属性】
技术研发人员：张枭，李培暠，付东旭，刘月学，王键，侯亚莉，赵玉辉，董文轩，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：