本发明专利技术属于生物工程技术领域，本发明专利技术涉及一种高产β‑葡萄糖苷酶的酿酒酵母及应用。酿酒酵母是高产β‑葡萄糖苷酶的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae pYES2(G418)‑bgl，该菌株于2022年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25945。本发明专利技术所用菌株与初始菌相比，β‑葡萄糖苷酶的酶活达到726.59±4.36U/mL，是初始菌株Bacillus licheniformis 15‑4的6.6倍，基因表达水平是初始菌株的4.3倍。抗氧化活性显著增强，具有广泛的应用前景。
1、淡豆豉为历版《中国药典》唯一收载的药食同源发酵类中药，具有解表除烦、宣发郁热之功效。淡豆豉的发酵基质为大豆，大豆蛋白和异黄酮苷类为其主要成分，通过发酵，β-葡萄糖苷酶可将异黄酮苷转化为苷元。
2、β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase,bgl)，全称为β-d-葡萄糖苷水解酶，又称为纤维二糖酶或龙胆二糖酶，作用于末端非还原性的β-d-葡萄糖苷键，使其水解，产生β-d-葡萄糖及相应配基。β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界各种微生物中和动植物体内，但该酶活力普遍较低，很大程度上限制了其酶大规模、高效的生产应用，为了获得活力更高的β-葡萄糖苷酶，现有技术通过基因工程手段提高β-葡萄糖苷酶活性。
3、其中，尽管有学者已经成功构建了β-葡萄糖苷酶的工程菌株，但是其酶活普遍较低。例如，邵金辉等从扣囊复膜孢酵母中成功克隆出β-葡萄糖苷酶基因，但未进行诱导表达；周衍等从扣囊复膜孢酵母中克隆出β-葡萄糖苷酶基因并在酿酒酵母中表达成功，其β-葡萄糖苷酶活力达到0.967u/ml；国外学者kawai等从黄孢原毛平革菌中克隆出β-葡萄糖苷酶基因，并采用pichia pastoris表达系统进行表达，其重组表达菌株的β-葡萄糖苷酶活力达到28.5u/ml。
>2、本专利技术的思路是通过异源表达来源于地衣芽孢杆菌15-4(bacilluslicheniformis 15-4)的β-葡萄糖苷酶基因，得到的β-葡萄糖苷酶基因与载体连接，构建表达载体，得到的表达载体转入酿酒酵母中，筛选阳性克隆，即得。3、为了实现上述目的，本专利技术提供了一株高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母saccharomyces cerevisiae pyes2(g418)-bgl，该菌株于2022年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究，保藏编号为cgmcc no.25945。
4、上述的一种高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母，高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母saccharomyces cerevisiae pyes2(g418)-bgl包含重组质粒与酿酒酵母表达宿主，所述重组质粒包含β-葡萄糖苷酶基因以及g418筛选标记的pyes2(g418)表达载体，所述β-葡萄糖苷酶基因bgl来自地衣芽孢杆菌。
5、上述的一种高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母的构建方法，包括如下步骤：
6、e)利用pcr扩增从地衣芽孢杆菌中获取β-葡萄糖苷酶基因；
7、f)将β-葡萄糖苷酶基因构建到g418筛选标记的pyes2(g418)载体上，得到重组质粒pyes2(g418)-bgl；
8、g)将重组质粒pyes2(g418)-bgl转化至酿酒酵母表达宿主；
9、h)筛选鉴定转化菌株，获得酿酒酵母基因saccharomyces cerevisiae pyes2(g418)-bgl。
10、11.根据权利要求3所述的一种新型高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤a)中，获取β-葡萄糖苷酶基因的引物序列如下(5'---3')：
11、p1：atggcgagacaaacgtgga
12、p2：ttatttataccggaattcctctgtttc。
13、上述的一种新型高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，步骤a)中，pcr反应体系及反应条件为如下表。
14、pcr反应体系
15、
16、pcr反应条件
17、
18、上述的一种新型高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，步骤b)中，将β-葡萄糖苷酶基因构建到g418筛选标记的pyes2(g418)载体上的pcr反应的条件如下：
19、pcr反应体系
20、
21、pyes2-g418载体通用引物序列(5'---3')：
22、p3：taatacgactcactataggg
23、p4：atcggactactagcagctgta
24、pcr反应条件如下表。
25、pcr反应条件
26、
27、上述的一种新型高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，步骤c)中，具体步骤如下：
28、1)从-20℃冰箱取出10mg/ml carrier dna，需沸水煮5min，迅速放置冰上；
29、2)在无菌台中取1支无菌ep管，各加5μl carrier dna，分别加入1000ngpyes2(g418)-bgl；
30、3)在往ep管中分别加入100μl酿酒酵母感受态及500μl peg/liac转化液，并轻轻混匀，30℃培养30min，每10min混匀一次；
31、4)加入20μl dmso，混匀，42℃水浴20min，每10min混匀一次；
32、5)700g离心5min，弃上清；
33、6)用1ml ypd plus medium重悬，30℃振荡培养90min；
34、7)700g离心5min，弃上清，用200μl 0.9％ nacl重悬；
35、8)各取100μl涂布ypda+500ngg418平板；
36、9)将上述平板倒置于30℃培养箱内培养3～5d。
37、上述的一种新型高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，步骤d)中，筛选鉴定转化菌株的方法包括以下步骤：
38、4)将pyes2(g418)-bgl转化至酿酒酵母宿主涂布ypd+g418筛选平板；
39、5)随机挑取10个菌斑分别培养并提取酵母质粒；
40、6)根据载体序列设计通用引物鉴定阳性克隆。
41、上述的一种新型高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，步骤d)中，阳性克隆鉴定的pcr反应的条件为：
42、pcr反应体系
43、
44、鉴定引物为(5'---3'):
45、p3：taatacgactcactataggg
46、p4：atcggactactagcagctgta
47、pcr反应条件如下。
48、pcr反应条件
49、
50、上述的一种新型高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母基因工程菌在淡豆豉发酵、啤酒发酵或葡萄酒发酵中的应用。
51、本专利技术的有益效果在于：
52、1.构建了酿酒酵母基因工程菌，提高了β-葡萄糖苷酶活性，酶活达到(本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母，其特征在于，是高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae pYES2(G418)-bgl，该菌株于2022年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25945。
2.根据权利要求1所述的一种高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母，其特征在于，高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae pYES2(G418)-bgl包含重组质粒与酿酒酵母表达宿主，所述重组质粒包含β-葡萄糖苷酶基因以及G418筛选标记的pYES2(G418)表达载体，所述β-葡萄糖苷酶基因bgl来自地衣芽孢杆菌。
3.权利要求1所述的一种高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的一种新型高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤a)中，获取β-葡萄糖苷酶基因的引物序列如下(5'---3')：
5.根据权利要求3所述的一种新型高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤a)中，PCR反应体系及反应条件为如下表。
6.根据权利要求3所述的一种新型高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤b)中，将β-葡萄糖苷酶基因构建到G418筛选标记的pYES2(G418)载体上的PCR反应的条件如下：
7.根据权利要求3所述的一种新型高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤c)中，具体步骤如下：
8.根据权利要求3所述的一种新型高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤d)中，筛选鉴定转化菌株的方法包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的一种新型高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤d)中，阳性克隆鉴定的PCR反应的条件为：
10.权利要求1所述的一种新型高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母基因工程菌在淡豆豉发酵、啤酒发酵或葡萄酒发酵中的应用。
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【技术特征摘要】
1.一种高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母，其特征在于，是高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母saccharomyces cerevisiae pyes2(g418)-bgl，该菌株于2022年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.25945。
2.根据权利要求1所述的一种高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母，其特征在于，高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母saccharomyces cerevisiae pyes2(g418)-bgl包含重组质粒与酿酒酵母表达宿主，所述重组质粒包含β-葡萄糖苷酶基因以及g418筛选标记的pyes2(g418)表达载体，所述β-葡萄糖苷酶基因bgl来自地衣芽孢杆菌。
3.权利要求1所述的一种高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的一种新型高产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤a)中，获取β-葡萄糖苷酶基因的引物序列如下(5'---3')：
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【专利技术属性】
技术研发人员：史海粟，乌日娜，王伟明，闫亦然，武俊瑞，周岩，徐菁雯，霍金海，史琳，王楠，胡心玉，赵玉莲，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：
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