一种针对多种类有毒有害甲藻生物的快速检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种应用三色荧光原位杂交技术快速检测海洋环境中多种类有毒有害甲藻(包括其休眠孢囊)的试剂盒及其使用方法。探针颜色包括绿色、蓝色和橙色。检测平台为一带有多个反应槽的玻璃平板(或其它透明材料)，每个槽定义为一个反应体系，每槽可同时检测3种甲藻，因此一套平板可开展呈矩阵样式的3

【技术实现步骤摘要】
一种针对多种类有毒有害甲藻生物的快速检测试剂盒


[0001]本专利技术属于海洋、环境生物技术和海关病原微生物检验检疫领域，具体涉及一种针对多种类有毒有害甲藻生物的快速检测试剂盒。

技术介绍

[0002]有害藻华是自然界的一种常见现象,它是由某些藻类在一定环境条件下爆发性的增加或累积所引起的,常在河口、海洋或淡水区域发生。已知世界范围内存在300种以上浮游植物可形成有害藻华，其中四分之一有害有毒。此外，这些能引起有害藻华的生物已被证明可通过传播压载水(泥)进行扩散，例如，有学者对我国日照港外来船舶压舱水中的浮游植物进行了调查，结果发现压舱水中含有较高的有害物种(硅藻36种，甲藻4种，金藻1种)。还有学者在福建省4个港口12艘外来轮船的压舱水样品,检出浮游植物7门86属240种(包括60种赤潮生物)。
[0003]统计显示约75％左右的海洋藻华事件由甲藻引起，且甲藻占有害藻华种类的约40％。甲藻有害藻华的形成除受外部环境影响外,还与其自身的生存策略有关。休眠孢囊(resting cyst)是甲藻生活史的重要阶段，不但可为藻华年际爆发与复发提供种源，还能通过自然和人为传播方式实现地理扩散甚至生物入侵，如通过养殖贝类的异地引种和通过压舱水及其沉积物(压舱泥)传播。基于此，建立多种类有毒有害甲藻营养细胞或休眠孢囊的快速检测技术十分必要。相关快检方法对监测、检测多种有毒有害甲藻在我国海域和入境船舶压舱水和泥中的存在性、分布、丰度等具有实际应用前景，可望为我国海洋有毒有害甲藻藻华的预警预测乃至防控治理提供重要的技术手段r/>[0004]目前，甲藻(包括其休眠孢囊)的鉴定主要包括传统形态学观察、分子生物学鉴定及多手段联合鉴定技术手段。(1)形态学方法主要利用光学或扫描电子显微镜对细胞的形状、大小、颜色、表面结构、内含物等特征进行鉴定和分类。然而，对于那些体积较小和形态结构高度简单的细胞(或孢囊),形态学方法往往很难甚至不可能准确鉴定。而且，形态学方法往往依赖于鉴定人员长期的经验积累。此外，休眠体的鉴定即使通过萌发后的营养细胞形态学进行，绝大多数情形也仅能鉴定到属水平，只有少数能鉴定到种。(2)分子生物学技术常用rDNA序列作为分子标记。基于分子标记的常见方法有普通PCR和实时荧光定量PCR技术、高通量测序技术、和荧光原位杂交技术。然而，基于基因测序的技术往往无法获得细胞形态学信息，而且死亡营养细胞或沉积物中残留的DNA有时也会被检测到，从而影响结果的准确性。(3)形态学观察结合高通量测序或者单细胞测序的组合检测技术具有鉴定准确性，但方法操作复杂、冗繁，涉及多种试剂仪器，不仅费时耗材，还可能导致检测过程一定的失败率，同时对操作者的技能要求也较高。因此，本专利技术针对性地研发了一种同时、快速、准确检测多种甲藻营养细胞和休眠孢囊的方法。

技术实现思路

[0005]针对传统和现行技术中存在的问题及不足，本专利技术的目的在于提供一种针对多种
类有毒有害的甲藻生物检测、监测和鉴定的检测方法及其试剂盒。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用技术思路为：
[0007]一种针对多种类有毒有害甲藻生物的快速检测试剂盒，含待检测有毒有害甲藻生物探针，且各探针修饰不同颜色的荧光标记。
[0008]所述有毒有害甲藻为米氏凯伦藻(Kareniamikimotoi)、剧毒卡尔藻(Karlodiniumveneficum)、东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)、太平洋亚历山大藻(Alexandriumpacificum)、安德森亚历山大藻(Alexandriumandersonii)、微小亚历山大藻(Alexandriumminutum)、红色赤潮藻(Akashiwosanguinea)、链状裸甲藻(Gymnodiniumcatenatum)和褐色马格里夫藻(Margalefidiniumfulvescens)。
[0009]所述待检测有毒有害甲藻为甲藻营养细胞或其休眠孢囊；所述荧光标记可为绿、蓝、橙，分别交叉标记不同甲藻的特异性探针。
[0010]所述待检测有毒有害甲藻的探针如下，各探针分别修饰荧光颜色标记，
[0011]序号种类探针1KareniamikimotoiAGTGACTGAATGTCCTCAGTTGAAC2KarlodiniumveneficumTCCTCTGTTTACGGTGTGCTTTCTA3ProrocentrumdonghaienseTTGTCTTCGGGTGAGTGAATAGC4AlexandriumpacificumGGTTTTGGCTGCAAGTGC5AlexandriumminutumAAACCTACTAACACAATGAA6AlexandriumandersoniiTCTGCCAGCATCTTTTCTGC7AkashiwosanguineaGCAACCGATCTGTCAACTGAGAG8GymnodiniumcatenatumTGTGTCATCATCAGTTTGGAGGT9MargalefidiniumfulvescensTGGAGTTGGTGTAAGTTTCGCGCTT
[0012]所述试剂盒内应包括甲藻特异性荧光探针干粉、0.5％浓度的细胞通透试剂、1
×
PBS溶液、杂交液、杂交检测平台。
[0013]所述杂交检测平台为设有多个反应槽的平板；每个反应槽中添加标记不同颜色的各甲藻特异性荧光探针。每个槽定义为一个反应体系。
[0014]以3种荧光颜色为例，每槽可同时检测3种甲藻，因此一套平板可开展呈矩阵样式的3
×
N种甲藻生物检测。
[0015]例如：蓝色可为AATO425,AMCA,Pacific Blue；绿色可为FAM,FITC,Alexa Fluor 532；橙色可为Cy3,Alexa Fluor 568。
[0016]一种利用所述的试剂盒检测甲藻生物的方法：
[0017]1)根据荧光标记的颜色种类设置反应槽个数，并将各样品依次加入各反应槽；
[0018]2)将探针随机分组，每组探针对应与之相匹配的目标甲藻，每种甲藻显现出的荧光颜色与探针修饰上的颜色相同，随后对探针进行标记修饰，且，每组探针中含标记不同颜色的各甲藻特异性荧光探针；
[0019]3)将步骤2)修饰的每组探针分别加入至不同的反应槽中，进行原位杂交通过每个反应槽中不同颜色进行区分待测样品中不同种类的甲藻。
[0020]所述步骤1)中样品使用固定剂按照常规方式进行固定；所述步骤3)将含有探针组的杂交液加入反应槽中于52℃避光孵育1h进行原位杂交，在55℃条件下洗脱，最后在显微
镜下观察颜色。
[0021]所述杂交液成分为0.9M NaCl,0.1％十二烷基硫酸钠,20mM Tris
‑
HCl,pH 7.2。
[0022]具体检测为：
[0023]1)将固定好的细胞于离心管离心。随后加入200μl 100％无水乙醇冰上孵育10min，随后弃上清。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对多种类有毒有害甲藻生物的快速检测试剂盒，其特征在于：含待检测有毒有害甲藻生物探针，且各探针修饰不同颜色的荧光标记。2.按权利要求1所述针对多种类有毒有害甲藻生物的快速检测试剂盒，其特征在于：所述有毒有害甲藻为米氏凯伦藻(Kareniamikimotoi)、剧毒卡尔藻(Karlodiniumveneficum)、东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)、太平洋亚历山大藻(Alexandriumpacificum)、安德森亚历山大藻(Alexandriumandersonii)、微小亚历山大藻(Alexandriumminutum)、红色赤潮藻(Akashiwosanguinea)、链状裸甲藻(Gymnodiniumcatenatum)和褐色马格里夫藻(Margalefidiniumfulvescens)。3.按权利要求1所述针对多种类有毒有害甲藻生物的快速检测试剂盒，其特征在于：所述待检测有毒有害甲藻为甲藻营养细胞或其休眠孢囊；所述荧光标记可为绿、蓝、橙，分别交叉标记不同甲藻的特异性探针。4.按权利要求2所述针对多种类有毒有害甲藻生物的快速检测试剂盒，其特征在于：所述待检测有毒有害甲藻的探针如下，各探针分别修饰荧光颜色标记，序号种类探针1KareniamikimotoiAGTGACTGAATGTCCTCAGTTGAAC 2KarlodiniumveneficumTCCTCTGTTTACGGTGTGCTTTCTA 3ProrocentrumdonghaienseTTGTCTTCGGGTGAGTGAATAGC 4AlexandriumpacificumGGTTTTGGCTGCAAGTGC 5AlexandriumminutumAAACCTACTAACACAATGAA 6Alexandriumander...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐赢中，刘宇洋，柴召阳，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：