一种PCR检测灰霉菌病原菌灰葡萄孢Botrytiscinerea的特异性引物及方法技术

本发明专利技术生物技术领域，具体涉及一种PCR检测灰霉菌病原菌灰葡萄孢Botrytis cinerea的特异性引物及方法，包括第一对特异性引物和第二对特异性引物，所述第一对特异性引物包括正向引物B.c

【技术实现步骤摘要】
一种PCR检测灰霉菌病原菌灰葡萄孢Botrytis cinerea的特异性引物及方法


[0001]本专利技术生物
，具体涉及一种PCR检测灰霉菌病原菌灰葡萄孢Botrytis cinerea的特异性引物及方法。

技术介绍

[0002]灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)也叫灰霉菌，所引起的灰霉病常见于多种植物，包括番茄、草莓、葡萄等水果，黄瓜、茄子等多种蔬菜以及田间作物。灰葡萄孢菌不仅可侵染植物的果实，造成果实腐烂；还会造成叶片和茎，花等器官不同程度的损害。灰霉菌具有易产孢，繁殖快、易变异、适应能力强的特点，冬天可在干枯的植物茎秆上过冬，待到温度适宜时，开始大量繁殖侵染植物。据报道，由灰霉菌引起的果蔬腐烂可造成25
‑
55％的损失，是农业生产中需重点防范和控制的病害。
[0003]灰霉菌的快速、早期、准确的检测是灰霉病正确诊断和早期防治的重要手段。目前关于病原菌的早期检测技术有很多，如拉曼光谱检测，环介导等温扩增检测、定量PCR检测、酶联免疫吸附检测以及常规的病原菌分离鉴定检测等。它们都有着各自的优缺点，如常规病原菌分离检测耗时长、步骤繁琐，容易错过病原菌防控的最佳时机，而拉曼光谱、定量PCR等对仪器等要求较高，技术难度大。普通PCR检测鉴定的方法，具有易操作，技术难度低等优点应用相对广泛，但也存在引物特异性或灵敏度不够高，可选择特异性引物不多等问题。基于此，本专利技术创作者经过查阅文献，以RNA聚合酶Ⅱ大亚基基因(RPB2)基因为靶点设计特异性引物，采用易操作、技术难度低的PCR方法对灰霉菌的快速检测进行探索与实践。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于解决如何快速简便、及时检测灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的存在，提供了一种PCR检测灰霉菌病原菌灰葡萄孢Botrytis cinerea的特异性引物及方法。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术公开了一种PCR检测灰霉菌病原菌灰葡萄孢Botrytis cinerea的特异性引物，包括第一对特异性引物和第二对特异性引物，所述第一对特异性引物包括正向引物B.c
‑
585和反向引物B.c1053，所述正向引物B.c
‑
585的序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物B.c1053的序列如SEQ ID NO.2所示；
[0006]所述第二对特异性引物包括正向引物B.c
‑
754和反向引物B.c1019，所述正向引物B.c
‑
754的序列如SEQ ID NO.3所示，所述反向引物B.c1019的序列如SEQ ID NO.4所示。
[0007]本专利技术还公开了上述一种PCR检测灰霉菌病原菌灰葡萄孢Botrytis cinerea的方法，包括以下步骤：
[0008]S1，采用改良CTAB法提取待测样品DNA；
[0009]S2，PCR扩增特异性引物；
[0010]S3，制备1％的琼脂凝胶，设置电泳参数。
[0011]所述步骤S1中改良CTAB法包括以下步骤：
[0012]S11，将菌丝加液氮在1.5mL离心管中用研磨棒研磨成细末，加入600μL预热至65℃的2
×
CTAB，颠倒混匀，65℃水浴30min；
[0013]S12，取出离心管冷却至室温，加入600μL氯仿：异戊醇溶液，振荡混匀，10000rpm离心10min，取上清液至另一1.5mL离心管中，再加入等体积氯仿：异戊醇溶液，10000rpm离心10min；
[0014]S13，取上清液至另一1.5mL离心管中，加入0.6倍体积的冷异丙醇，轻轻颠倒混匀，
‑
20℃放置1h，10000rpm离心10min；
[0015]S14，去上清，加入70％无水乙醇清洗2次，室温干燥后用适量无菌ddH2O溶解沉淀的DNA，
‑
20℃保存备用。
[0016]所述步骤S2中PCR扩增程序具体如下：
[0017]25μL PCR体系：1
×
Taq MasterMix12.5μL，上下游引物各0.5μL，模板DNA1μL，ddH2O；
[0018]PCR程序设定：95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，循环32次，72℃延伸10min。
[0019]所述步骤S3中电泳参数为：电压168V，电流290mA，时间16min。
[0020]与现有技术比较本专利技术的有益效果在于：
[0021]本专利技术所使用的两对特异性引物，不仅能特异性的检测出灰葡萄孢菌，在果实上的检测结果也证明特异性引物检测结果也与常规病原菌分离结果检测一致，准确性强，特异性强，灵敏性高，引物B.C585
‑
1053最低可检测出0.1ng/μL浓度的DNA，引物B.C754
‑
1019可检出DNA浓度最低为1ng/μL。能准确检测到感染时间短的果实，为灰葡萄孢的早期感染建立预警机制。
附图说明
[0022]图1为引物特异性检测，a：引物B.c
‑
585/B.c
‑
1053，b：引物B.c
‑
754/B.c
‑
1019；
[0023]图2为分离病原菌DNA检测，a：引物B.c
‑
585/B.c
‑
1053，b：引物B.c
‑
754/B.c
‑
1019；
[0024]图3为患病果实DNA检测，a：引物B.c
‑
585/B.c
‑
1053，b：引物B.c
‑
754/B.c
‑
1019；
[0025]图4为果实DNA电泳图，a：引物B.c585
‑
1053，b：引物B.c754
‑
1019，c：ITS通用引物；
[0026]图5为果实DNA电泳图，a：引物B.c585
‑
1053，b：引物B.c754
‑
1019，c：ITS通用引物；
具体实施方式
[0027]以下结合附图，对本专利技术上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
[0028]本实施例中的两对特异性引物如下：
[0029]第一对特异性引物，正向引物B.c
‑
585和反向引物B.c1053，可针对灰葡萄孢特异性扩增出468bp的产物。其序列分别为：
[0030]B.c
‑
585：TCGAGATCCTGCTCATTTGGTC
[0031]B.c
‑
1053：AGTTGGATTGATAGGTGCCTTA
[0032]第二对特异性引物，正向引物B.c
‑
754和反向引物B.c1019，可针对灰葡萄孢特异性扩增出265bp本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PCR检测灰霉菌病原菌灰葡萄孢Botrytis cinerea的特异性引物，其特征在于，包括第一对特异性引物和第二对特异性引物，所述第一对特异性引物包括正向引物B.c
‑
585和反向引物B.c1053，所述正向引物B.c
‑
585的序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物B.c1053的序列如SEQ ID NO.2所示；所述第二对特异性引物包括正向引物B.c
‑
754和反向引物B.c1019，所述正向引物B.c
‑
754的序列如SEQ ID NO.3所示，所述反向引物B.c1019的序列如SEQ ID NO.4所示。2.一种PCR检测灰霉菌病原菌灰葡萄孢Botrytis cinerea的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，采用改良CTAB法提取待测样品DNA；S2，PCR扩增特异性引物；S3，制备1％的琼脂凝胶，设置电泳参数。3.如权利要求2所述的一种PCR检测灰霉菌病原菌灰葡萄孢Botrytis cinerea的方法，其特征在于，所述步骤S1中改良CTAB法包括以下步骤：S11，将菌丝加液氮在1.5mL离心管中用研磨棒研磨成细末，加入600μL预热至65℃的2
×
CT...

【专利技术属性】
技术研发人员：李欢欢，苏倩，吴阳，于淑坤，王军节，
申请(专利权)人：北方民族大学，
类型：发明
国别省市：