肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７Ｔｉｒ与Ｔｃｃｐ的重组蛋白制造技术

本发明专利技术涉及肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７转位紧密粘附素受体（Ｔｉｒ）与内膜素受体偶联细胞骨架蛋白（Ｔｃｃｐ）重组蛋白的制备方法及应用，属于生物技术领域。取ｔｉｒ和ｔｃｃｐ基因Ｃ端序列串联克隆，获得ｐＧＥＭ－Ｔ－ｔｉｒ－ｔｃｃｐ重组质粒，构建重组质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ｔｉｒ－ｔｃｃｐ，转化入感受态细胞ＢＬ２１（ＤＥ３）中，获得重组菌株，经ＩＰＴＧ诱导后获得高效表达。本发明专利技术制备的重组蛋白Ｔｉｒ－Ｔｃｃｐ具有良好的免疫原性，可诱导机体产生高滴度的保护性抗体。Ｔｉｒ－Ｔｃｃｐ可作为研制亚单位疫苗的候选多价融合蛋白，为预防和治疗肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７感染提供了技术平台和防控手段。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
肠出血性大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７转位紧密素受体Ｔｉｒ与内膜素受体偶联细胞骨架蛋白ＴｃｃＰ重组蛋白，其特征在于，是由以下方法获得的：　　（１）获取ｔｉｒ和ｔｃｃｐ基因Ｃ端序列，并串联克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体设计并合成两对特异性引物，以Ｏ１５７：Ｈ７ＥＤＬ９３３制备的ＤＮＡ为模板，分别扩增ｔｉｒ和ｔｃｃｐ基因Ｃ端１２４３ｂｐ和８２５ｂｐ序列，引物序列如下：　　Ｔｉｒ－Ｐ１：５’－ｔａｃｇｇａｔｃｃａｃｔｃｔｔａａｃａｇｇｃａｇａｔｔｇｇ－３’电泳鉴定，可以看到一条２０６８ｂｐ的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得重组质粒ｐＧＥＭＴ－ｔｉｒ４１４－ｔｃｃｐ２７５；　　（２）ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ｔｉｒ－ｔｃｃｐ重组质粒的构建　　ｐＧＥＭＴ－４Ｔ－１－ｔｉｒ４１４－ｔｃｃｐ２７５重组质粒和表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１质粒分别用ＢａｍＨ　Ⅰ、Ｘｈｏ　Ⅰ双酶切，回收ｔｉｒ－ｔｃｃｐ重组基因和ｐＧＥＸ－４Ｔ－１酶切片段，Ｔ４ＤＮＡ酶连接，构建重组质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－ｔｉｒ－ｔｃｃｐ，连接反应体系：１０×Ｔ４　ＤＮＡＬｉｇａｓｅｂｕｆｆｅｒ１．０μＬ，Ｔ４ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ１．０μＬ，ｐＧＥＸ－４Ｔ－１酶切片段３．０μＬ，目的片段１．２μＬ，灭菌ｄｄＨ２Ｏ　３．８μＬ。上述试剂混匀后于４℃连接１８ｈ～２４ｈ，将连接产物转化于感受态ＢＬ２１（ＤＥ３）中，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用ＢａｍＨ　Ⅰ和Ｘｈｏ　Ⅰ双酶切，３７℃水浴２小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可出现２０６８ｂｐ片段，即获阳性重组菌质粒ＢＬ２１（ｐＧＥＸ４Ｔ－１－ｔｉｒ－ｔｃｃｐ）；　　（３）Ｔｉｒ－ＴｃｃＰ重组融合蛋白的表达　　挑取经过酶切鉴定为阳性的单菌落，３７℃振荡培养过夜，同时转化ｐＧＥＸ－４Ｔ－１空质粒做阴性，将培养菌液按体积比２％接种于Ａｍｐ工作浓度为１００μｇ／ｍＬ的ＬＢ液体培养基中，３７℃震荡培养至ＯＤ↓［６００］≈０．４～０．６，加入ＩＰＴＧ至终浓度为１ｍＭ，之后在３０℃继续培养７ｈ进行诱导表达，收集菌液进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，诱导菌液离心收集菌体重悬于ＰＢＳ缓冲液中，超声裂解后，１００００ｇ离心２０ｍｉｎ，收集上清和沉淀分别进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，以确定表达目的蛋白存在形式，在上清中可以清晰看到分子量大小为１０２ｋＤ目的蛋白，表明表达蛋白主要以可溶性形式存在于菌体蛋白中，即为Ｔｉｒ－ＴｃｃＰ重组蛋白。Ｔｉｒ－...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何孔旺，张雪寒，卢维彩，赵攀登，温立斌，郭容利，李彬，王小敏，倪艳秀，吕立新，周俊明，俞正玉，茅爱华，周萍，沈江萍，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]