一种虾青素用于乳腺炎疾病治疗的实验方法技术

本发明专利技术公开了一种虾青素治疗乳腺炎疾病治疗的实验方法，具体包括以下内容:S1、本实验选取分娩后3至15天的ICR小鼠作为实验对象，实验分为组，分别是空白对照组(NT)、单独给药组(Ax)、乳腺炎模型组(LPS)、药物治疗组(LPS+Ax)，每组9只小鼠，S2、用戊巴比妥钠(45mg/kg)将小鼠麻醉并保定，然后在小鼠的第四对乳头内注射LPS(0.2mg/kg)用于构建乳腺炎模型，并在24h后收集样品，此虾青素首用于治疗乳腺炎的实验方法，通过石蜡切片的方法检测了乳腺组织的病理损伤情况，利用荧光定量PCR技术评估了乳腺组织中炎性基因IL

【技术实现步骤摘要】
一种虾青素用于乳腺炎疾病治疗的实验方法


[0001]本专利技术涉及医学
，具体为一种虾青素用于乳腺炎疾病治疗的实验方法。

技术介绍

[0002]奶牛乳腺炎又称为奶牛乳房炎，是奶牛的三大疾病之一，同时也是兽医临床上常见且危害严重的疾病，其每年对农牧业养殖造成巨大的经济损失。奶牛乳腺炎按照其分类，可以分为临床型乳腺炎和隐性乳腺炎。临床型乳腺炎的主要症状是乳腺有典型的红、肿、热、痛、乳汁中可见血色乳凝块以及乳腺组织发生相关炎症反应、乳汁理化性质改变，体细胞增多，细菌含量上升等为主要特征，并且乳腺组织内伴有强烈的炎症反应，炎症基因如TNF
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α、IL
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1β等急剧升高，其中基因IL
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1β在炎症的发展过程中发挥重要推动作用，进而加剧炎症反应进程。隐性乳腺炎其临床症状不明显，但是其体细胞数升高，可达到50万～500万之间。核因子
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κB(nuclear factor
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kappa B，NF
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κB)蛋白家族是一种多效性的转录因子，可以与多种基启动子部位的κB位点发生特异性的结合从而促进其转录表达。其受氧化应激、细菌脂多糖，细胞因子等多种刺激而活化后，能调控前炎症性细胞因子、细胞表面受体、转录因子、粘附分子等的生成。而IκB
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α与NF
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κB信号传导途径相关的转录因子相互作用从而保持NF
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κB转录失活，因此通过抑制IκB
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α信号轴可以一定程度上缓解炎症发生。
[0003]一直以来，抗生素是奶牛乳腺炎治疗的首选药物，不仅对急性临床乳腺炎有明显的效果，还能够有效防止败血症的发生。但是抗生素的滥用催生了多重耐药菌株的出现，使得目前常用的抗生素已经无法治疗一些广泛传播的致病菌，并且抗生素在发挥作用时选择性较低，不但能够杀灭病原菌，还会杀死益生菌，使得乳腺内的正常菌群平衡遭到破坏。

技术实现思路

[0004](一)解决的技术问题
[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种虾青素用于乳腺炎疾病治疗的实验方法，本专利技术具备药物提取材料来源广泛、治疗乳腺的效果明显、不引起牛奶中抗生素残留、不易引起细菌耐药等优点，有利于解决奶牛乳腺炎治疗过程中抗生素残留、耐药细菌的产生以及备选治疗药物不足等问题。
[0006](二)技术方案
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种虾青素用于乳腺炎疾病治疗的实验方法，具体操作如下：
[0008]S1、选择8周龄的ICR小鼠进行合笼，每笼1公2母，待小鼠分娩后3至15天内完成小鼠乳腺炎症模型的构建，实验分为4组，分别是空白对照组(NT)、单独给药组(Ax)、乳腺炎模型组(LPS)和药物治疗组(LPS+Ax)，每组9只小鼠；
[0009]S2、每天上午9点通过灌胃的方式给小鼠摄入虾青素，共给药12次，给药浓度为120mg/kg；
[0010]S3、小鼠与第11、13、15天注射LPS后，第16天收集乳腺样品，取出一部分乳腺组织
用于石蜡切片的制作并观察乳腺组织的病理损伤情况；
[0011]S4、取一部分乳腺组织用于测定乳腺组织中炎性基因IL
‑
Iβ的表达情况，评估乳腺组织内炎症反应的严重程度。
[0012]S5、取一部分乳腺组织用于测定IκB
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α信号轴的表达情况
[0013]具体的western blot的步骤为：将新鲜的组织放在2mL离心管中研磨并加入蛋白裂解液，12000r/min离心10分钟抽取上清即为总蛋白，采用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度，根据蛋白浓度将每个样品的蛋白分成等浓度，以ddH2O、Acry
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Bis、PH 6.8、PH 8.8、10％ SDS、10％ APS、TEMED按比例配制成4％浓缩凝胶和12％分离凝胶，随后，进行12％十二烷基硫酸钠
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聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS
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PAGE)，使用PVDF膜(Millipore，Darmstadt，Germany)进行转移，使用一抗将PVDF膜在4℃下孵育过夜，最后，山羊抗兔或小鼠二抗与PVDF膜室温孵育1h，根据使用说明，使用增强型化学发光试剂盒进行蛋白条带的检测，获取数据后分析IκB
‑
α信号轴的表达情况。
[0014]优选的，所述小鼠乳腺炎模型的构建方法为：用浓度为45mg/kg的戊巴比妥钠麻醉小鼠，并将其固定，在第四对乳区周围用75％的酒精消毒，用剪刀剪掉乳头约1mm，然后用量程为100uL的微量注射器，注射进乳头30pL且浓度为0.2mg/mL的LPS，收集乳腺样品保存在
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80C冰箱中。
[0015]优选的，所述石蜡切片的制作过程如下：提前用PBS配置好浓度为4％的甲醛溶液，取出新鲜的乳腺组织用PBS涮洗其溢出的乳汁并用滤纸蘸干，然后放入甲醛溶液中固定48h，经过不同浓度的酒精梯度脱水、包埋、切片、H&E染色等步骤获取石蜡切片，最后评估乳腺组织的病理损伤情况。
[0016]优选的，步骤S4中荧光定量PCR的步骤为：将新鲜的乳腺组织放在1.5mL离心管中研磨并加入Trizol，反转录得到cDNA，以20μL体系为单位分别加入上游引物1μL、下游引物1μL、10倍稀释的cDNA模板8μL、PCRmix10μL并放入荧光定量PCR仪器内，获取数据后分析乳腺组织内炎性基因IL
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1β的表达情况。
[0017](三)有益效果
[0018]与现有技术相比，本专利技术提供了一种虾青素用于乳腺炎疾病治疗的实验方法，具备以下有益效果：
[0019]1、该虾青素用于乳腺炎疾病治疗的实验方法，通过乳腺组织石蜡切片、H&E染色的方法，从病理组织学的角度出发，证明了虾青素减少了小鼠乳腺组织的炎性细胞的浸润、缓解了乳腺腺泡的萎缩、缓解了腺泡间质之间的增厚。有力的证明了虾青素对LPS诱导的小鼠乳腺炎具有良好的治疗作用。
[0020]2、该虾青素用于乳腺炎疾病治疗的实验方法，通过注射的方式给药，以利于药物中有效成分的充分吸收。具有方便携带、抗炎效果明显、不易产生细菌耐药性、不产生抗生素残留等优点。
[0021]3、该虾青素用于乳腺炎疾病治疗的实验方法，通过分子生物学
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荧光定量PCR的实验方法，检测了乳腺组织中促炎基因IL
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Iβ的表达情况。实验结果表明虾青素有效的降低了炎性基因IL
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1B的表达。该结果从基因层面上证实了虾青素对LPS诱导的小鼠乳腺炎具有较好的治疗作用。
附图说明
[0022]图1为本专利技术中虾青素的分子结构示意图；
[0023]图2为本专利技术中虾青素对LPS诱导的小鼠乳腺炎治疗效果图；
[0024]图3为本专利技术中虾青素抑制IL
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1β、TN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种虾青素用于乳腺炎疾病治疗的实验方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、选择8周龄的ICR小鼠进行合笼，每笼1公2母，待小鼠分娩后3至15天内完成小鼠乳腺炎症模型的构建，实验分为4组，分别是空白对照组(NT)、单独给药组(Ax)、乳腺炎模型组(LPS)和药物治疗组(LPS+Ax)，每组9只小鼠；S2、每天上午9点通过灌胃的方式给小鼠摄入虾青素，共给药12次，给药浓度为120mg/kg；S3、小鼠与第11、13、15天注射LPS后，第16天收集乳腺样品，取出一部分乳腺组织用于石蜡切片的制作并观察乳腺组织的病理损伤情况；S4、取一部分乳腺组织用于测定乳腺组织中炎性基因IL
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Iβ的表达情况，评估乳腺组织内炎症反应的严重程度；S5、取一部分乳腺组织用于测定IκB
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α信号轴的表达情况具体的western blot的步骤为：将新鲜的组织放在2mL离心管中研磨并加入蛋白裂解液，12000r/min离心10分钟抽取上清即为总蛋白，采用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度，根据蛋白浓度将每个样品的蛋白分成等浓度，以ddH2O、Acry
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Bis、PH 6.8、PH 8.8、10％SDS、10％APS、TEMED按比例配制成4％浓缩凝胶和12％分离凝胶，随后，进行12％十二烷基硫酸钠
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聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS
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PAGE)，使用PVDF膜(Millipore，Darmstadt，Germany)进行转移，使用一抗将...

【专利技术属性】
技术研发人员：付守鹏，郭文晋，耿睿奇，柳巨雄，柳舒，胡惠洁，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：