天山雪莲黄酮醇合酶基因及其编码产物和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种天山雪莲黄酮醇合酶基因及其编码产物和应用，属于植物基因工程和基因编辑技术领域，天山雪莲黄酮醇合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术还提供天山雪莲黄酮醇合酶基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明专利技术还提供含有所述基因的重组载体pET32a

【技术实现步骤摘要】
天山雪莲黄酮醇合酶基因及其编码产物和应用


[0001]本专利技术属于药用植物基因工程
，涉及天山雪莲黄酮醇合酶基因(SiFLS)及其编码产物和应用。

技术介绍

[0002]天山雪莲(Saussurea involucrata)的干燥地上部分可以入药，称为“雪莲花”，是珍贵的中草药资源。天山雪莲作为维吾尔族的常用药，具有营养神经，补肾活血，调节异常体液，强筋骨等功效，在临床上主要用于治疗月经不调，小腹疼痛，风寒湿痹痛等。天山雪莲生长环境特殊，主要分布在我国新疆内的天山，阿勒泰和昆山等山脉；同时，由于天山雪莲自然繁殖率低，生长缓慢，加上人们毁灭性采挖与不合理利用，导致其野生资源濒临灭绝。
[0003]天山雪莲中的主要活性成份为黄酮类物质、雪莲多糖和生物碱，其中又以黄酮类物质为主要功效成份。黄酮醇类物质作为黄酮类化合物的重要成员，由黄酮醇合酶(flavonol synthase,FLS)开启合成，以二氢黄酮醇，如二氢山萘酚(dihydrokaempferol,DHK)、二氢槲皮素(dihydroquercetin,DHQ)、二氢杨梅素(dihydromyricetin,DHM)等为底物，生成山萘酚(kempferol)、杨梅素(myricetin)、槲皮素(quercetin)等黄酮醇；这些产物通过甲基转移酶、糖基转移酶和酰基转移酶等酶的活性进一步修饰生成多种黄酮醇衍生物。现有技术中还没有公开天山雪莲中二氢杨梅素的催化酶。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题在于提供天山雪莲黄酮醇合酶(SiFLS)基因及其编码产物，以及该产物在药物中的应用。
[0005]本专利技术所提供的天山雪莲黄酮醇合酶(SiFLS)基因，为以下核甘酸序列之一：
[0006](1)具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
[0007](2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
[0008]本专利技术还提供SiFLS基因所编码的天山雪莲黄酮醇合酶，所述天山雪莲黄酮醇合的氨基酸为下列序列之一：
[0009](1)具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
[0010](2)SEQ ID NO.2添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。
[0011]本专利技术还提供了含有所述基因的重组载体pET32a
‑
SiFLS。
[0012]本专利技术还提供所述基因在调控天山雪莲黄酮醇类活性物质以二氢杨梅素为底物生成杨梅素的应用。
[0013]本专利技术还提供所述的重组载体pET32a
‑
SiFLS在调控天山雪莲黄酮醇类活性物质以二氢杨梅素为底物生成杨梅素的应用。
[0014]本专利技术与现有技术相比的有益效果如下：
[0015]本专利技术中获得的SiFLS基因是调控天山雪莲黄酮醇类物质合成的关键基因，这对
于通过分子育种手段获得高黄酮醇的天山雪莲植株具有重要意义；对SiFLS基因进行分子调控，能够增加天山雪莲中药用成分的含量，对于提高药用植物有效活性成分的含量具有重要的参考意义。SiFLS基因编码的天山雪莲黄酮醇合酶以二氢杨梅素为底物，生成产物杨梅素。
附图说明
[0016]图1：SiFLS基因cDNA琼脂糖凝胶电泳检测结果；
[0017]图2：SiFLS功能域预测分析结果；
[0018]图3：pET32a
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SiFLS重组蛋白SDS
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PAGE凝胶电泳图谱：
[0019]M，marker，1、重组质粒上清液，2、重组质粒沉淀，3、重组质粒纯化蛋白，4、空载对照上清液，5、空载对照沉淀，6、空载对照纯化蛋白；
[0020]图4：SiFLS体外酶活检测结果。(a)为288nm下混标样品(反应体系所有成份及产物杨梅素)，(b)为368nm下对照组酶活产物，(c)为368nm下实验组酶活产物。
具体实施方式
[0021]下述实施例中所用的材料、试剂、载体和大肠杆菌等，如无特殊说明，均可从公司通过商业途径购买，所述PCR扩增反应Marker购自全式金生物公司，PCR扩增反应酶购自TaKaRa公司，蛋白电泳实验所用Marker购自全式金生物公司。
[0022]实施示例1：天山雪莲全长cDNA文库的构建
[0023]取天山雪莲实生苗嫩叶部位，用TransZol法(全式金生物公司)提取嫩茎总RNA，使用核酸分析仪检测总RNA的含量和纯度，取总RNA做逆转录反应，所用试剂盒为EasyOne
‑
Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(全式金生物公司)。具体步骤如下：
[0024]1.1匀浆：取保存在
‑
80℃的天山雪莲组织样品，转移到液氮预冷的研钵中，用研杵将植物样品研磨至粉末状。取50
‑
100mg(约为管的1/5)研磨后样品装入2mL充分预冷离心管中(管中的液氮要打匀去除，防止崩盖)，再加入1mL的TransZoL震荡混匀。
[0025]1.2分层：匀浆样品冰上放置5min(使核蛋白物质完全分离)。加入200μL氯仿，盖紧管盖，剧烈振摇3s，冰上放置3min。用冷冻离心机4℃下高速离心约15min，使其分层，得到无色的上清液、白色的中间层蛋白以及红色的下层有机相。
[0026]1.3RNA的沉淀：室温下，取上清液约550
‑
650μL(保证质量的前提下尽量吸取)转移至新的2mL离心管中(此离心管需要充分预冷)。加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀，
‑
20℃放置10min。在4℃下，高速离心10min，弃上清(尽量除去异丙醇)。
[0027]1.4RNA漂洗：加入至少1mL的75％乙醇，涡旋混匀后4℃下7500g离心5min。1.5RNA再溶解：弃上清，吸干乙醇，开盖于室温下晾干20min。加入30
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40μL的RNase
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free ddH2O(4℃保存，冰上放置)溶解RNA2
‑
3min。
[0028]1.6使用琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪检测总RNA的含量和纯度。
[0029]1.7RNA反转录：反转录体系如下：
[0030][0031]先将RNA模板、Anchored Oligo(dT)与RNase
‑
free Water混匀，于65℃孵育5min，冰浴2min，然后加入其他的反应成分。轻轻混匀，42℃孵育15min。在85℃温度下加热5s将Trans Script RT与gDNA Remover失活，即得到天山雪莲cDNA文库。
[0032]实施例2：SiFLS基因克隆及原核表达载体构建
[0033]2.1以天山雪莲cDNA为模板，利用简并引物：
[0034]F：5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种天山雪莲黄酮醇合酶基因，简写为SiFLS，其特征在于，所述基因的核甘酸序为以下列之一：(1)具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。2.权利要求1所述SiFLS基因所编码的天山雪莲黄酮醇合酶，其特征在于，所述天山雪莲黄酮醇合酶的氨基酸为下列序列之一：(1)具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；(2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：付春祥，吴振映，张亚茹，徐悦，孔秀雅，刘雨辰，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：