高产α-亚麻酸的重组酵母菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了重组酵母菌及其构建方法与应用。本发明专利技术重组酵母菌的构建方法包括将delta

【技术实现步骤摘要】
高产
α
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亚麻酸的重组酵母菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物工程领域中产α
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亚麻酸的酵母菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]ω
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3不饱和脂肪酸主要包括三种：α
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亚麻酸(α
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Linolenic acid，ALA)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)，可降血压和胆固醇，有益心血管系统健康，是动物生长，大脑发育等所必需的脂肪酸。其中，α
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亚麻酸是合成EPA和DHA的前体，但是由于人和其他哺乳动物体内没有能从脂肪酸的甲基端数起的第三个碳和第六个碳上导入双键的脱氢酶，所以自身不能合成α
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亚麻酸，需要从饮食或饲料中获取。在获取α
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亚麻酸后，可在体内通过去饱和作用和碳链延长作用将其进一步转化为EPA和DHA。所以，哺乳动物必需的EPA和DHA不一定非要从外部直接获取，该方式价格昂贵；其可以通过摄入α
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亚麻酸，在动物体内代谢衍生获取，这种转化更自然，也更经济有效。然而现有饲料中的脂肪酸成份不全，配比不均衡，缺乏包括α
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亚麻酸在内的ω
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3不饱和脂肪酸。因此如何研发出具有高质量、高市场竞争力的优质动物饲料(或宠物食品)已经成为国内外宠物食品企业和研发机构面临的首要难题。
[0003]α
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亚麻酸的学名为顺式十八碳三烯
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9，12，15
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酸，是一种必需氨基酸，有诸多生理功能，如降血脂、防血栓等。研究表明富含α
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亚麻酸的饲料可明显促进生长育肥猪肌肉组织蛋白质的合成速度，加速试验猪的日增重，同时还可提高红细胞膜中不饱和脂肪酸的组成，有利于血液循环。还能够促进大规格鲈鱼的生长，提高抗氧化能力与肝脏健康水平。金曙光等的研究表明，当饲料中添加4.5％的α
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亚麻酸时，奶牛的奶产量、奶脂率、奶蛋白和游离脂肪酸都显著增加。目前，动物饲料里添加的ω
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3不饱和脂肪酸的主要来源为鱼油、菜籽油和亚麻籽油等，这些添加剂的生产工序复杂费时，价格昂贵，资源稀缺，受天气和环境的影响较大，导致该类动物饲料生产成本高，售卖价格昂贵等。
[0004]酵母是营养价值很高的单细胞蛋白，酵母类饲料添加剂也具有较高的营养价值，含多种蛋白质，氨基酸，微生素及微量矿物质，还具有廉价易得，生产周期短，不受天气环境影响等特点，在饲料行业已有不少应用。
[0005]圆红冬孢酵母作为一种产油酵母，生长周期短、利用碳源广泛，被认为是一株具有广泛应用前景的菌株。通过对酵母产α
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亚麻酸途径的编辑，提高α
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亚麻酸的产量，并将该工程酵母菌株添加到动物饲料中，从而改善动物饲料ω
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3不饱和脂肪酸的配比，研发具有更高质量优质动物饲料(或宠物食品)。营养学和分子生物学的交叉，使得人们可以从基因表达角度提高ω
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3不饱和脂肪酸的产量，并通过饲料添加提高动物的免疫功能和生产力，具有重要的营养价值和经济意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的一个技术问题是如何提高酵母菌(例如圆红冬孢酵母菌)产α
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亚麻酸的能力，以使其可作为动物饲料来为动物提供足够的必需脂肪酸。
[0007]为了解决以上技术问题，本专利技术提供了高产α
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亚麻酸的重组酵母菌的构建方法。本专利技术所提供的重组酵母菌的构建方法，包括将delta
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15脂肪酸去饱和酶的编码基因(FAD15)导入受体酵母菌，得到的重组酵母菌；所述delta
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15脂肪酸去饱和酶可为X1、X2或X3的蛋白质：
[0008]X1、氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO:1(LuFAD15)、SEQ ID NO:2(HpFAD15)、SEQ ID NO:3(VfFAD15)和SEQ ID NO:4(RgFAD15)中任一所示的氨基酸；
[0009]X2、将X1所示的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个以上氨基酸残基得到的与X1所述的蛋白质具有80％以上的同一性且具有delta
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15脂肪酸去饱和酶活性的蛋白质；
[0010]X3、在X1或X2所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。
[0011]所述蛋白标签(protein
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tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签蛋白可为Flag标签蛋白、His标签蛋白、MBP标签蛋白、HA标签蛋白、myc标签蛋白、GST标签蛋白和/或SUMO标签蛋白等。
[0012]上述方法中，所述delta
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15脂肪酸去饱和酶的编码基因(FAD15)可为x1
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x3中的任一种DNA分子：
[0013]x1)其编码序列是序列表中SEQ ID NO:5的第6927
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8099位(LuFAD15，编码SEQ ID NO:1第2
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392位所示氨基酸序列)、SEQ ID NO:6的第2887
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4083位(RgFAD15，编码SEQ ID NO:4的第2
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400位所示氨基酸序列)、SEQ ID NO:7(VfFAD15，编码SEQ ID NO:3所示氨基酸序列)和SEQ ID NO:8(HpFAD15，编码SEQ IDN O:2所示氨基酸序列)中任一所示的cDNA分子或基因组DNA；
[0014]x2)在严格条件下与x1)限定的DNA分子杂交且编码所述delta
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15脂肪酸去饱和酶的cDNA分子或基因组DNA；
[0015]x3)与x1)或x2)限定的DNA分子具有80％以上的同一性且编码所述delta
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15脂肪酸去饱和酶的cDNA分子或基因组DNA。
[0016]上述方法中，所述重组酵母菌的构建方法还可包括如下A和/或B的步骤：
[0017]A、将delta
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9脂肪酸去饱和酶的编码基因(FAD9)导入所述受体酵母菌步骤，所述delta
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9脂肪酸去饱和酶可为A1或A2的蛋白质：
[0018]A1、由序列表中SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0019]A2、在序列表中SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有delta
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9脂肪酸去饱和酶活性的由A1衍生的蛋白质；
[0020]B、将delta
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.构建重组酵母菌的方法，其特征在于：包括将delta
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15脂肪酸去饱和酶的编码基因导入受体酵母菌，得到的重组酵母菌；所述delta
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15脂肪酸去饱和酶为X1、X2或X3的蛋白质：X1、氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中任一所示的氨基酸；X2、将X1所示的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个以上氨基酸残基得到的与X1所述的蛋白质具有80％以上的同一性且具有delta
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15脂肪酸去饱和酶活性的蛋白质；X3、在X1或X2所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述重组酵母菌的构建方法还包括如下A和/或B的步骤：A、将delta
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9脂肪酸去饱和酶的编码基因导入所述受体酵母菌步骤，所述delta
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9脂肪酸去饱和酶为A1或A2的蛋白质：A1、由序列表中SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列组成的蛋白质；A2、在序列表中SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有delta
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9脂肪酸去饱和酶活性的由A1衍生的蛋白质；B、将delta
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12脂肪酸去饱和酶的编码基因导入所述受体酵母菌步骤，所述delta
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12脂肪酸去饱和酶为A1或A2的蛋白质：B1、由序列表中SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列组成的蛋白质；B2、在序列表中SEQ ID NO:...

【专利技术属性】
技术研发人员：史硕博，郭霄，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：