一种大蒜AsFMO1基因的功能鉴定与应用制造技术

本发明专利技术公开了参与大蒜蒜氨酸生物合成的关键基因AsFMO1及其功能鉴定和应用，属于植物生物技术领域。本发明专利技术提供一种大蒜遗传转化方法并通过AsFMO1基因过表达和CRISPR/Cas9基因编辑技术验证了AsFMO1基因为大蒜蒜氨酸生物合成的关键基因。获得的高蒜氨酸的转基因大蒜，为大蒜育种工作和蒜氨酸作为医药中间体的应用做出一定的贡献，具有一定的实际应用价值。值。值。

【技术实现步骤摘要】
一种大蒜AsFMO1基因的功能鉴定与应用


[0001]本专利技术涉及在大蒜蒜氨酸生物合成关键基因AsFMO1的功能鉴定和应用。属于分子生物学和生物


技术介绍

[0002]大蒜是一种重要的调味品和药用植物，蒜氨酸是自然界中仅存于大蒜中的含硫氨基酸，同时也是大蒜中主要生物活性物质之一。蒜氨酸具有独特的药理作用，包括抗炎、降血糖、抗肿瘤、降血脂和保护肝脏等。研究表明从头合成蒜氨酸优先在含有叶绿体的细胞中生成，所以大蒜叶片是蒜氨酸合成的主要部位，随着生长周期的转移，蒜氨酸不断利用维管系统运输到鳞茎等部位。
[0003]由于蒜氨酸酶只利用S
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烯丙基
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L
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半胱氨酸亚砜，而不利用生物合成的中间硫化物作为底物水解生成各种具有生物活性的含硫化合物，所以中间硫化物的S
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氧化是生物合成S
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烯丙基
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L
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半胱氨酸亚砜的重要步骤之一。含黄素单加氧酶(FMO；EC 1.14.13.8)负责催化立体选择性高的S
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氧化反应，依赖黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD，Flavin adenine dinucleotide)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH，Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)。
[0004]目前，关于蒜氨酸生物合成分子机制知之甚少，其合成过程中的相关酶及复杂的分子调控机制仍需进一步发掘和研究。本研究通过克隆AsFMO1并进行qRT
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PCR分析、亚细胞定位、通过农杆菌介导的大蒜遗传转化方法构建AsFMO1过表达株系和敲除突变体以及蒜氨酸含量测定等方法对AsFMO1进行功能验证和应用，证明了AsFMO1为大蒜蒜氨酸生物合成的关键基因。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于公开一种参与大蒜蒜氨酸生物合成的关键基因AsFMO1及其功能鉴定和应用。
[0006]本专利技术提供了一种农杆菌介导的大蒜遗传转化方法，用此方法将AsFMO1基因转入大蒜中，导致大蒜蒜氨酸含量发生明显变化。
[0007]本专利技术第一个目的是提供一个大蒜蒜氨酸生物合成关键基因AsFMO1，所述AsFMO1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]进一步，扩增莱芜白蒜中的该基因CDS序列构建过表达载体，通过农杆菌瞬时侵染烟草叶片细胞发现AsFMO1蛋白定位在细胞质和细胞核。
[0009]进一步，AsFMO1基因通过qRT
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PCR表明主要在鳞茎膨大期的叶片中表达量较高。
[0010]进一步，所述基因编码一个Flavin
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containing monooxygenase含单加氧酶，调控葱属植物中蒜氨酸的合成；调控蒜氨酸含量。
[0011]本专利技术的第二个目的是提供一种大蒜蒜氨酸生物合成关键基因AsFMO1的应用。
[0012]进一步，扩增莱芜白蒜中的该基因CDS序列构建过表达载体，通过农杆菌介导的遗
传转化方法获得转基因植株可以大幅提高基因表达水平与蒜氨酸含量。
[0013]进一步，通过设计双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体，获得的移码突变突变体具有基因表达水平下降与蒜氨酸含量显著降低的特征。
[0014]进一步，通过对AsFMO1基因编辑创制了高蒜氨酸含量的植株，该材料可以用于蒜氨酸作为医药中间体的生产加工。
[0015]本专利技术还提供了包含AsFMO1基因序列的重组表达载体、引物序列、重组菌，任一包含该基因序列的重组表达载体也属于本专利技术的保护范围。
[0016]有益效果：
[0017]本专利技术克隆了一个可以调节大蒜蒜氨酸生物合成的基因。本专利技术提供了AsFMO1在大蒜育种和蒜氨酸作为医药中间体方面的应用。该基因突变体蒜氨酸含量明显下调；同时该基因过表达株系蒜氨酸含量明显上调，可以作为大蒜蒜氨酸医药中间体生产加工的材料。
(四)附图说明
[0018]图1为AsFMO1基因在大蒜不同组织中的表达图
[0019]A代表发芽期，B代表幼苗期，C代表鳞茎膨大期
[0020]图2为AsFMO1蛋白亚细胞定位图
[0021]图3为AsFMO1基因过表达载体构建图
[0022]A代表AsFMO1基因扩增图，M代表分子量标记；B代表AsFMO1基因过表达载体菌液PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图，1
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6代表菌液PCR中扩增的AsFMO1基因条带，7代表阴性对照；C代表AsFMO1基因过表达载体示意图
[0023]图4为AsFMO1基因CRISPR/Cas9载体构建图
[0024]A代表靶点位置示意图；B代表PCR扩增靶点琼脂糖凝胶电泳图，M代表分子量标记；C代表PCR扩增靶点琼脂糖凝胶电泳图；D代表AsFMO1基因CRISPR/Cas9载体菌液PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图，1
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8代表菌液PCR阳性克隆，9代表阴性对照
[0025]图5为转化植株的再生过程图
[0026]A代表大蒜鳞茎发芽图，B代表在愈伤组织诱导培养基上形成愈伤组织图，C代表愈伤组织继代培养图，D代表侵染后共培养图，E代表抗性愈伤组织筛选图，F代表在分化培养基上不定芽发育图，G代表在生根培养基上无菌苗生根图，H代表无菌苗移栽图
[0027]图6为阳性转基因植株PCR检测图
[0028]M代表分子量标记，1代表重组质粒SV
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Cas9
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AsFMO1
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Bar阳性对照，2
‑
3代表不同的敲除抗性株系，4代表阴性对照，5代表未转化植株，6代表重组质粒pCOMBIA3300
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AsFMO1
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eGFP阳性对照，7
‑
9代表不同的过表达抗性株系，10代表阴性对照，11代表未转化植株
[0029]图7为T0代突变植株的分析图
[0030]A代表PCR扩增含有靶位点的AsFMO1片段，M代表分子量标记，1代表asfmo1
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1突变体基因组，2代表asfmo1
‑
2突变体基因组；B代表AsFMO1靶点序列峰图；C代表AsFMO1靶点序列比对图；D代表AsFMO1突变蛋白氨基酸序列
[0031]图8为转基因植株中AsFMO1基因表达图
[0032]图9为蒜氨酸含量测定图
[0033]A代表未转化植株蒜氨酸色谱图，B代表asfmo1突变体株系蒜氨酸色谱图，C代表OE过表达株系蒜氨酸色谱图，D代表蒜氨酸的含量。
[0034](五)具体专利技术实施方式
[0035]以下将结合具体实施例来进一步描述本专利技术。明确指出，这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制，本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种参与大蒜蒜氨酸生物合成的关键基因AsFMO1，其特征在于如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。2.权利要求1所述基因编码的蛋白氨基酸序列，其特征在于如SEQ ID NO.2所示序列。3.一种载体，其特征在于，包含权利要求1所述的全部核苷酸序列。4.一种重组蛋白，其特征于，包含权利要求2所述氨基酸序列。5.一种农杆菌介导的大蒜遗传转化方法，该方法步骤如下：(1)以健康、无损坏的蒜瓣为外植体，将所述外植体放置于4℃冰箱一个月，用于打破休眠，将所述打破休眠的外植体剥去外层保护叶并除去基部褐色蒜踵，在超净工作台中，用75％乙醇浸泡15min，倒掉75％乙醇，用无菌水冲洗干净，于4％次氯酸钠消毒灭菌30min，弃净4％次氯酸钠，用无菌水冲洗3～5次，将所述消毒后的外植体置于含有适量无菌水的枪头盒中，25℃暗培养7d左右至长出根尖，用灭菌后的解剖刀切取所述外植体根尖部位1cm左右接种于愈伤组织诱导培养基中，25℃暗培养4周左右，得愈伤组织；所述愈伤诱导培养基中包含以下浓度的原料：MS，1g/L 2,4
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D，1mg/L 6
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BA，30g/L蔗糖，7g/L琼脂；(2)将所述愈伤组织浸泡在侵染菌液中浸泡10min，浸泡期间需不停振荡，得侵染后的愈伤组织；所述侵染菌液为活化后的携带有重组质粒的农杆菌菌液；(3)吸干所述侵染后的愈伤组织表面液体后，平铺于共培养基上暗培养3d后，转移至一筛培养基中暗培养15～20d，再转移至二筛培养基中暗培养15～20d，得抗性愈伤组织；所述共培养基中包含以下浓度的原料：MS，1mg/L 2,4
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D，1mg/L 6
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BA，30g/L蔗糖，7g/L琼脂，100μM AS；所述一筛培养基中包含以下浓度的原料：MS，1mg/L 2,4
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D，1mg/L 6
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BA，30g/L蔗糖，7g/L琼脂，400mg/L Cef，15mg/L Basta；所述二筛培养基中包含以下浓度的原料：MS，1mg/L 2,4
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D，1mg/L 6
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BA，30g/L蔗糖，7g/L琼脂，400mg/L Cef，30mg/LBasta；(4)将所述抗性愈伤组织接种于分化培养基上进行诱导培养，得不定芽；所述分化培养基中包含以...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨彩霞，
申请(专利权)人：杨彩霞，
类型：发明
国别省市：