【技术实现步骤摘要】
(一)本专利技术涉及大蒜含黄素单加氧酶基因家族及其编码基因与功能分析。属于分子生物学和生物信息分析领域。
技术介绍
0、(二)
技术介绍
1、黄素单加氧酶(flavoprotein monooxygenases，fpmos)是一种单组分或双组分的酶，可进行各种不同类型的氧化反应，如区域选择性羟基化和对映选择性亚砜化，其催化反应涉及黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)、黄素单核苷酸(fmn)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)等辅助因子(或辅酶)进一步激活o2发挥作用。黄素单加氧酶分为a-h8个亚类，其中b类黄素单加氧酶具有典型的fad和nad(p)h两个二核苷酸结合结构域，并依据序列相关性，将b类黄素单加氧酶分为3个亚类，包括：含黄素单加氧酶(flavin-containing monooxygenases，fmos)、拜尔-维利格单加氧酶(baeyer-villigermonooxygenases，bvmos)和n-羟基化单加氧酶(n-hydroxylatingmonooxygenases，nmos)。
2、不同于bvmos和nmos，fmos具有独特的序列基序fxgxxxhxxxy/f，用于特异性催化含杂原子化合物的氧化，fmos最早在肝微粒体中被发现，起初命名为“混合功能氧化酶”，后改为含黄素单加氧酶。由于fmos能够氧化一系列底物(包括芳香烃，酮和软亲核杂原子)，所以参与多种生物合成途径并起到重要作用。
3、植物中含黄素单加氧酶是约50kda的蛋
4、目前，关于大蒜中的含黄素单加氧酶基因家族知之甚少，其在大蒜中所发挥的功能需要发掘和研究。本研究通过克隆asfmos并进行结构域分析、保守基序分析、染色体定位分析、蛋白三维结构分析、进化分析对asfmos进行了鉴定和初步功能分析。通过对asfmos家族成员进行qrt-pcr分析、亚细胞定位分析进一步研究其功能。
技术实现思路
0、(三)
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于公开大蒜含黄素单加氧酶基因家族asfmos及其编码基因与功能分析。
2、本专利技术第一个目的是大蒜含黄素单加氧酶基因家族asfmos的鉴定与初步功能分析，所述asfmos基因家族的核苷酸序列如权利要求1所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如权利要求2所示。
3、进一步，根据二水早大蒜基因组注释信息进行筛选，初步筛选到49条候选序列后将其提交至蛋白质结构域预测网站(interpro、pfam、smart)进行验证，发现asa3g05097.1、asa4g04959.1、asa4g04963.1、asa5g05156.1和asa6g04803.1都含有fmo识别结构域、nadp结合结构域和fad结合结构域，最终在大蒜基因组中鉴定到5个asfmos成员。
4、进一步，通过序列比对发现5个asfmos成员均含有fad-binding、nadp-binding、tgy和fmo-identifying特征序列。
5、进一步，通过meme网站分析大蒜asfmos家族成员的基因结构，发现asfmos家族所有成员均含有外显子和内含子且存在一定差异。
6、进一步，基于大蒜基因组的物理位置，通过mg2c网站分析asfmos家族成员的染色体定位信息，其中chr.4染色体上存在两个成员，为asa4g04959.1和asa4g04963.1；chr.3、chr.5、chr.6染色体上都各有1个成员，分别为asa3g05097.1、asa5g05156.1、asa6g04803.1。
7、进一步，通过phyre2软件得到asfmos家族成员蛋白三维结构模型，asa3g05097.1、asa4g04959.1和asa4g04963.1蛋白都是以c6wpua为模板，且都与大蒜s-烯丙基-l-半胱氨酸s-加氧酶晶体结构高度相似，asa5g05156.1蛋白与asa6g04803.1蛋白三维结构与菊粉血杆菌的fmo晶体结构相似。
8、进一步，通过ncbi上进行blast，获得与asfmos家族成员同源性较高的21个基因的蛋白序列，通过mega11.0进行分析发现asa3g05097.1与os10g0553800亲缘关系最近，asa5g05156.1和asa6g04803.1都与os11g0207700亲缘关系最近，asa4g04959.1和asa4g04963.1与拟南芥(at5g07800、at5g61290)亲缘关系最近。
9、本专利技术的第二个目的是提供asfmos家族成员的功能分析。
10、进一步，asfmos基因家族成员通过qrt-pcr表明asa4g04963.1和asa5g05156.1在大蒜组织中表达量均较低，asa3g05097.1在鳞茎膨大期初期、后期和成熟期的叶片中表达量较高，asa4g04959.1在鳞茎膨大期的成熟期叶片中表达量较高，asa6g04803.1在发芽期和幼苗期的贮藏叶中表达均高于其他组织。
11、进一步，分别扩增莱芜白蒜中的asfmos家族成员cds序列构建过表达载体，通过农杆菌瞬时侵染烟草叶片细胞发现asfmos家族成员主要定位在细胞质。
12、本专利技术还提供了包含asfmos基因家族序列的重组表达载体、引物序列、重组菌，任一包含该基因家族序列的重组表达载体也属于本专利技术的保护范围。
13、有益效果：
14、本专利技术鉴定了大蒜含黄素单加氧酶基因家族asfmos。本专利技术提供了asfmos家族成员在大蒜中的功能分析。本专利技术为asfmos表达调控的研究提供了方向，同时也为利用转基因技术创新作物新种质奠定了基础。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种大蒜含黄素单加氧酶基因家族AsFMOs，所述AsFMOs基因家族包括Asa3G05097.1、Asa4G04959.1、Asa4G04963.1、Asa5G05156.1和Asa6G04803.1，所述Asa3G05097.1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Asa4G04959.1的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述Asa4G04963.1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Asa5G05156.1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述Asa6G04803.1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.权利要求1所述Asa3G05097.1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述Asa4G04959.1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述Asa4G04963.1的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述Asa5G05156.1的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述Asa6G04803.1的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
3.一种AsFMOs基因家族鉴定与功能分析方法
4.权利要求1所述AsFMOs在大蒜育种中的应用。
5.权利要求1所述AsFMOs在大蒜含黄素单加氧酶功能研究中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种大蒜含黄素单加氧酶基因家族asfmos，所述asfmos基因家族包括asa3g05097.1、asa4g04959.1、asa4g04963.1、asa5g05156.1和asa6g04803.1，所述asa3g05097.1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述asa4g04959.1的核苷酸序列如seqid no.2所示，所述asa4g04963.1的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述asa5g05156.1的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述asa6g04803.1的核苷酸序列如seq id no.5所示。
2.权利要求...
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