PpCYP94A1基因在调控桃流胶病抗性中的应用制造技术

本发明专利技术涉及PpCYP94A1基因在调控桃流胶病抗性中的应用，本发明专利技术通过基因工程手段，将CDS区扩增，并运用同源重组法将目的片段与过表达载体pSAK277融合，成功构建过表达载体，通过农杆菌介导法在桃苗中过表达PpCYP94A1，获得具有流胶病抗性的植株材料；并选取特异片段构建VI GS载体，转入桃苗中降低其表达进一步验证功能；所述开放阅读框全长序列引物为SEQ I D NO：1和SEQ I D NO：2；所述特异性目标片段引物序列为SEQ I D NO：3和SEQ I D NO：4。本发明专利技术通过转基因手段提高桃树对流胶病菌的抗性，显著降低流胶病发病率，减少桃流胶病对产业带来的经济损失。经济损失。经济损失。

【技术实现步骤摘要】
PpCYP94A1基因在调控桃流胶病抗性中的应用


[0001]本专利技术涉及提高桃的抗病性方法领域，具体涉及PpCYP94A1基因在调控桃流胶病抗性中的应用。

技术介绍

[0002]桃流胶病分布范围广泛。该病严重破坏树体皮层结构，阻碍营养物质运输；造成树势衰弱、甚至是枝干枯死；影响桃树生产年限、果实产量和品质。
[0003]马铃薯细胞色素P450家族中CYP86和CYP94亚家族成员已鉴定为ω
‑
羟化酶，参与木栓质脂肪结构的羟基化(Franke and Schreiber,2007)。此外，在拟南芥中，CYP94还参与茉莉酸代谢途径，钝化茉莉酸信号途径的转导，影响植物对病原菌侵染的抗病防御反应(Abraham,2020)。目前，尚未发现极抗桃流胶病的抗性材料，解析桃树的抗性基因是桃生产中亟待解决的问题。因此深入研究桃中细胞色素P450基因具有重要的意义，研究结果将为流胶病的防治和抗流胶病材料的创制提供重要的理论基础。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于基于目前抗流胶病的桃资源的缺乏，提供PpCYP94A1基因在调控桃流胶病抗性中的应用。
[0005]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
[0006]PpCYP94A1基因在调控桃流胶病抗性中的应用，所述PpCYP94A1基因的序列为SEQ ID NO：5。
[0007]进一步，通过基因工程的方法过表达桃PpCYP94A1基因来提高桃流胶病抗性。
[0008]进一步，通过构建过表达载体，用农杆菌介导法在桃中过表达PpCYP94A1基因从而提高桃对流胶病菌的抗性；采用的VIGS沉默的目标片段的序列为SEQ ID NO：6，采用的VIGS
‑
PpCYP94A1中目标片段的引物序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
[0009]本专利技术的有益效果为：本专利技术可通过基因工程手段提高桃树对流胶病菌的抗性，可显著降低流胶病发病率，减少因桃流胶病带来的经济损失。
附图说明
[0010]图1为PpCYP94A1的进化树及氨基酸序列比对分析；
[0011]图2为PpCYP94A1基因全长的电泳照片；
[0012]图3为不同桃品种接种桃流胶病菌后的发病症状和病斑比较；
[0013]图4为PpCYP94A1基因在不同桃品种接种流胶病菌后的相对表达量；
[0014]图5为PpCYP94A1的亚细胞定位；
[0015]图6为沉默PpCYP94A1基因的桃植株的沉默效率以及接种流胶病菌后的发病症状和病斑面积；
[0016]图7为过表PpCYP94A1基因的桃植株的相对表达量以及接种流胶病菌后的发病症
状和病斑面积；
[0017]图8为转基因烟草的阳性鉴定；
[0018]图9为转基因烟草植株和对照植株接种桃流胶病菌后的发病症状和病斑面积。
具体实施方式
[0019]以下对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。
[0020]我们通过病原菌JMB
‑
122接种后桃枝条的转录组数据筛选出了一个响应桃流胶病Lasiodiplodiatheobromae菌株的基因PpCYP94A1,发现其在不同敏感性桃品种的表达水平与桃对流胶病菌的抗性呈正相关关系。基于转基因技术，在本氏烟中异源过表达该基因，发现转基因植株对桃流胶病菌的抗性增强。同时通过农杆菌介导的瞬时超表达，在桃苗中超表达该基因，发现其叶片对桃流胶病的抗性显著增强；以及用VIGS在桃苗中沉默该目的基因，发现抗性减弱，证明了该基因在桃抗流胶病中的重要作用。
[0021]主要实验过程如下：
[0022]1、PpCYP94A1基因的克隆与分析
[0023]从桃cDNA中克隆获得PpCYP94A1 CDS全长序列(1530bp)。生物信息学分析cDNA序列显示，该基因全长1530bp，包括509个氨基酸，等电点为8.67，预测分子量为57.6KDa。利用MEGA7进行氨基酸的多序列对比、构建系统进化树，发现其与苹果和水稻中的CYP94A1亲缘关系最近(图1中A图)。在NCBI数据库中，PpCYP94A1基因位于8号染色体，包含1个外显子，含有多个底物识别位点(SRS)(图1中B图)。
[0024]从桃DNA中克隆PpCYP94A1启动子片段(2000bp)。使用PlantCARE数据库分析该启动子顺式调控元件。PpCYP94A1启动子中含有6个MYB识别元件、3个MYC识别元件以及多种激素响应元件(见表1)，这类元件可被MYB、MYC蛋白及其他蛋白结合。
[0025]表1 PpCYP94A1启动子顺式作用元件分析
[0026][0027]根据全长序列，利用Primer 5在ORF两端设计引物，引物序列为：
[0028]PpCYP94A1
‑
Full
‑
length
‑
F：5
’‑‑
ATGTTTCTTCAGCTCTTAACCTTGG
‑‑3’
(SEQ ID NO：
1)
[0029]PpCYP94A1
‑
Full
‑
length
‑
R：5
’‑‑
TCAAGCCCTCTCCACAATGGT
‑‑3’
(SEQ ID NO：2)
[0030]以
‘
大红袍
’
和
‘
春雪
’
接种流胶病菌的当年生枝条韧皮部组织为样本，利用EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab，Beijing)分别提取总RNA，Nanodrop one(Thermo，USA)对RNA浓度和质量进行检测，利用反转录试剂盒PrimerRT Reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa,Dalian,China)说明书进行操作，反转录得到cDNA，最后以得到的cDNA为模板，用Phanta Max Super
‑
Fidelity DNA Polymerase(Vazyme，Nanjing)扩增
‘
大红袍
’
和
‘
春雪
’
中该蛋白编码基因ORF序列。扩增获得的产物利用DNA凝胶回收试剂盒(Sangon Biotech，Shanghai)回收目的片段、利用Zero Background pTOPO
‑
Blunt CloningKit(Aidlab，Beijing)连接载体得到阳性克隆后，送TSINGKE公司(TSINGKE，Wuhan)进行测序获得序列，我们发现在桃不同抗性品种
‘
春雪
’
和
‘
大红袍
’
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.PpCYP94A1基因在调控桃流胶病抗性中的应用，其特征在于，所述PpCYP94A1基因的序列为SEQ ID NO：5。2.根据权利要求1所述的PpCYP94A1基因在调控桃流胶病抗性中的应用，其特征在于，通过基因工程的方法过表达PpCYP94A1基因来提高桃对桃流胶病的抗性。3.根据权利要求1所述的PpCYP94A1基因在调控桃...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘军伟，沈兴仪，张东梅，朱凯杰，黄雪，李国怀，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：