卡那霉素降解酶AquKGDγ基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了卡那霉素降解酶AquKGDγ基因及其应用。AquKGDγ基因的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。AquKGDγ能将卡那霉素（氨基环醇4,6

【技术实现步骤摘要】
卡那霉素降解酶AquKGD
γ
基因及其应用


[0001]本专利技术涉及生物基因领域，具体涉及卡那霉素降解酶AquKGDγ基因及其应用。

技术介绍

[0002]抗生素耐药所造成的危害已成为感染性疾病治疗工作的巨大威胁。研究发现，在过去70年耐药细菌急剧增加的主要原因是在环境残留抗生素的选择压力下，水平转移促进了耐药基因的广泛传播和增殖。因此，解决细菌耐药问题首先要解决环境中残留的抗生素。残留抗生素的消除主要包括非生物作用(活性污泥的吸附、光解以及水解等)和生物作用(主要为微生物降解)。目前，非生物作用降解残留抗生素研究和实践较多，集中在理化处理，如高温法、微波法、光降解法、超声法、化学氧化法和电化学法等。理化处理法具有很多缺点，如所需成本普遍较高而管理较为复杂。此外大部分方法去除率都较低并对固态介质中抗生素残留的去除存在局限性。抗生素的生物降解由于价格低廉、环境污染小等优点逐渐成为研究热点，而酶降解被认为是抗生素生物去除最有前途的方法。
[0003]氨基糖苷类抗生素是一类水溶性强、可以对抗大部分革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的广谱性抗生素。因对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、克雷伯菌属等常见革兰氏阴性杆状细菌有较长的抗菌后效，氨基糖苷类抗生素被广泛应用于由敏感需氧型革兰氏阴性杆状细菌所导致的严重感染，如皮肤软组织感染、呼吸道感染、脑膜炎、烧伤感染、尿道感染、骨关节感染及胃肠道感染等。由于结构的稳定，氨基糖苷类抗生素在自然环境中很难借助光、温度等物理因素进行降解；更糟糕的是，迄今为止，氨基糖苷类抗生素被认为是不可生物降解的。在细菌中仅仅发现通过修饰酶对这类抗生素的氨基或羟基进行化学修饰，这种修饰会导致氨基糖苷类抗生素的失活，但并不涉及化学键的断裂，并且由于修饰发生在细胞内，修饰后的产物没有运输到细胞外，这类酶钝化氨基糖苷类抗生素效率极低。目前没有将这类修饰酶应用于氨基糖苷类抗生素污染治理的报道。氨基糖苷类抗生素的广泛应用和难以降解意味着亟需更有效的降解方法对环境中残留的这类抗生素进行去除。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供卡那霉素降解酶AquKGDγ基因及其应用。
[0005]本专利技术从菌株Aquamicrobium sp A3
‑
1中分离到能将卡那霉素(氨基环醇4,6
‑
O
‑
氨基糖二苷)降解为氨基环醇6
‑
O
‑
氨基糖苷的复合酶，命名为AquKGD。AquKGD由两个蛋白组成，分别命名为AquKGDα和AquKGDγ。AquKGDα大小为61,710Da，编码基因命名为kdr
‑
a，长度1686bp；AquKGDγ大小为21,450Da，编码基因为kdr
‑
b，长度588bp。
[0006]本专利技术所述AquKGDα基因(kdr
‑
a)的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]本专利技术所述AquKGDγ基因(kdr
‑
b)的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术kdr
‑
a基因编码的蛋白AquKGDα、kdr
‑
b基因编码的蛋白AquKGDγ能将卡那霉素(氨基环醇4,6
‑
O
‑
氨基糖二苷)降解为氨基环醇6
‑
O
‑
氨基糖苷。卡那霉素经AquKGDα或AquKGDγ降解后的产物失去了对细菌的抑菌活性，此外，对降解产物的细胞毒性进行评估，
发现与同浓度的母体卡那霉素相比，毒性显著降低。该结果表明用AquKGDα或AquKGDγ对环境中的卡那霉素进行降解修复时不会引起二次污染，具有应用可行性。
附图说明
[0009]图1为硫酸铵沉淀法纯化蛋白流程图。
[0010]图2为不同硫酸铵沉淀区进行离子交换后部分收集管的卡那霉素降解活性及其蛋白条带。
[0011]图3为不同硫酸铵沉淀区的离子交换图谱。
[0012]图4为60
‑
70％硫酸铵沉淀区收集管活性及SDS
‑
PAGE。
[0013]图5为菌体破碎液离子交换后44号收集管非变性凝胶电泳(A)及目标条带切胶回收后SDS
‑
PAGE(B)和活性验证(C)
[0014]图6为实施例2的目标基因。
[0015]图7为kdr
‑
a和kdr
‑
b连接到不同表达载体时在E.coli BL21DE3中的表达。
[0016]图8为kdr
‑
a和kdr
‑
b基因同时在同一个E.coli BL21DE3细胞中双表达时破碎上清液的SDS
‑
PAGE图。
[0017]图9为kdr
‑
a和kdr
‑
b基因体外表达蛋白降解卡那霉素废水中的卡那霉素。
[0018]图10为kdr
‑
a和kdr
‑
b基因体外表达蛋白降解卡那霉素生产菌渣中的卡那霉素。
[0019]图11为kdr
‑
a和kdr
‑
b基因体外表达后用于养殖水体中卡那霉素残留的降解。
具体实施方式
[0020]以下结合附图和实施例对本专利技术做进一步说明。以下未注明具体条件的实验方法，按照本领域常规实验条件或者制造厂商所建议的条件。
[0021]本专利技术所涉及的菌株Aquamicrobium sp A3
‑
1，已在文献“Deglycosylation Inactivation Initiated by a Novel Periplasmic Dehydrogenase Complex Provides a Novel Strategy for Eliminating the Recalcitrant Antibiotic Kanamycin[J].Environmental Science&Technology,2023”中公开发表。
[0022]本专利技术从菌株Aquamicrobium sp A3
‑
1中分离到能将卡那霉素(氨基环醇4,6
‑
O
‑
氨基糖二苷)降解为氨基环醇6
‑
O
‑
氨基糖苷的复合酶，命名为AquKGD。AquKGD由两个蛋白组成，分别命名为AquKGDα和AquKGDγ。AquKGDα大小为61,710Da，编码基因命名为kdr
‑
a，长度1686bp；AquKGDγ大小为21,450Da，编码基因为kdr
‑
b，长度588bp。
[0023]其中，AquKGDα基因(kdr
‑
a)的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，AquKGDγ基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.卡那霉素降解酶基因，其特征在于：所述卡那霉素降解酶命名为AquKGDγ，AquKGDγ基因的核酸序列如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明兹，陈志红，陈必链，陈立文，方森海，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：