基于不对称RPA的CRISPR/Cas12a检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于不对称RPA的CRISPR/Cas12a检测试剂盒及其应用。方法探究了Cas12a对不同的原间隔子相邻基序(PAM)序列的偏好性，并给出了打破PAM局限的方法，扩大CRISPR/Cas12a的应用范围。对于没有PAM序列的双链DNA(dsDNA)靶标，Asy

【技术实现步骤摘要】
基于不对称RPA的CRISPR/Cas12a检测试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物病毒和细菌检测领域，具体涉及一种不对称RPA的CRISPR/Cas12a检测方法。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas12a目前在生物检测和传感领域中占有重要地位，由于其独有的特异性和灵敏度。具体而言，该系统凭借PAM位点和crRNA引导Cas12a寻找和识别靶标。在识别正确的靶标后，Cas12a的顺式和反式切割活性被激活分别切割靶标和周围的任意的单链DNA(ssDNA)。通过这样的过程，CRISPR/Cas12a系统在核酸检测领域中受到了巨大的关注。RPA结合CRISPR/Cas12a实现了对核酸的快速检测。CRISPR/Cas12a比色技术结合RT
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RPA对SASR
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CoV进行快速检测，准确性达到95.12％，检测限低至50copies每反应。RPA结合CRISPR/Cas12a的一锅式反应检测非洲猪瘟和羊痘病毒。CRISPR/Cas12a与功能化的AuNPs结合，对Grapevine Red
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Blotch Viral实现可视化检测。由此可见，CRISPR/Cas12a在检测方法和生物传感器领域中有重要地位。更重要的是，CRISPR/Cas12a的靶标可以是ssDNA也可以是双链DNA(dsDNA)。不同的是，在识别dsDNA时，必须有PAM位点才能激活Cas12a的活性；而识别ssDNA时，不需要PAM位点。因此在dsDNA检测中，比如一些肿瘤核酸标志物、细菌以及其耐药性和双链DNA病毒，会受到PAM位点的限制。由于检测位点不一定存在PAM位点，这会极大地限制CRISPR/Cas12a的应用范围。为了解决这个问题，研究人员想出多种无PAM位点限制的方法。比如，在RPA的引物5
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端设计磷酸集团，利用Lambda消化带有5
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磷酸的链的能力消化RPA产物，产生ssDNA结合Cas12a的活性。另外，polyA polymerase(I)对miRNA的3
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端添加ploy A尾巴，再通过反转录形成cDNA，进行RPA扩增，其产物带上了PAM位点来激活Cas12a。还有在forward inner primer(FIP)的F2and F1c的连接处添加了PAM序列，利用LAMP对靶标扩增，实现无PAM位点限制的CRISPR/Cas12a检测。然而这些方法设计复杂或者需要繁冗的步骤来增添PAM位点或者产生单链DNA来摆脱PAM位点的限制，这是耗时的并且不利于快速检测的。
[0003]牛结节性皮肤病病毒LSDV，与绵羊痘病毒(GTPV)和山羊痘病毒(SPPV)同属于羊痘病毒。他们会分别感染牛、山羊和绵羊，引起动物们高烧、厌食、消瘦，在皮肤上会出现突起，严重影响产奶量和毛皮质量。他们被世界卫生组织定为法定报告疫病，给农业带来巨大的经济损失。更重要的是，他们三者之间基因同源性高达97％，是很难区分的。经过仔细比对，发现在基因VARV B22R上，LSDV比GTPV和SPPV多36
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38bp。基于此区域，我们设计方法去特异性识别LSDV。
[0004]结核分枝杆菌(MTB)是引起结核病(TB)的疾病，是对人类生命的严重威胁，它具有高度的毒性和传染性。先前的研究人员已经研究了治疗效果良好的药物，如异烟肼(INH)、利福平(RIF)。然而，在没有诊断和经验性治疗的情况下广泛使用药物导致结核分枝杆菌出现显著的耐药性。这对完全根除结核分枝杆菌构成了巨大的挑战。世卫组织制定了到2035年结束结核病流行，到2050年根除结核病的目标。区分耐药性和野生型结核分枝杆菌尤为
重要。研究发现，耐RIF的TB(MDR
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TB
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RIF)菌株在RNA聚合酶β
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亚基(rpoB)基因中有超过87个突变。其中，531密码子(C531)和526密码子(C526)的突变与耐药性密切相关，突变率高达56％和25％。因此，基于这些密码子对于区分突变型TB(MT
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TB)和野生型TB(WT
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TB)至关重要。

技术实现思路

[0005]为此，本专利技术开发了一种不对称RPA(Asy
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RPA)结合CRISPR/Cas12a方法消除PAM位点的限制，并用于LSDV检测和区分MT
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TB和WT
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TB。Asy
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RPA以dsDNA为模板，可以生成大量的ssDNA。Cas12a识别ssDNA的能力被充分用于检测dsDNA病毒LSDV。Asy
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RPA在技术上解决了PAM限制的问题。更重要的是，Asy
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RPA可以在恒温下快速反应，不依赖大型仪器，可以与CRISPR/Cas12a协同发生单管反应。此外，如果没有PAM位点，CRISPR/Cas12a可以在背景信号很少的情况下区分出ssDNA上的错配。基于这一性能，CRISPR/Cas12a与Asy
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RPA结合，鉴定出了WT
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TB和MT
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TB。该方法的检测限为1fM。这种灵敏和特异的方法为根除和治疗结核病提供了一种实用的技术，同时也为没有PAM的其他核酸提供了新的想法。目前国内外尚无Asy
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RPA结合CRISPR/Cas12a方法用于LSDV、MT
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TB和WT
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TB检测。因此，建立Asy
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RPA结合CRISPR/Cas12a的检测方法，这对于海关口岸、养殖场、基层动物疫病防控机构对LDSV的快速和准确检测，以及鉴定WT
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TB和MT
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TB具有重要意义。
[0006]鉴于此，本专利技术的第一个目的是建立不对称RPA结合CRISPR/Cas12a的检测试剂盒，拓展CRISPR/Cas12a的应用范围。第二个目的是提供一种基于不对称RPA结合CRISPR/Cas12a对LSDV的检测试剂盒及检测方法，第三个目的是提供基于不对称RPA结合CRISPR/Cas12a鉴别耐药性TB和野生型TB的试剂盒和方法。
[0007]为了实现第一个目的，本专利技术采用的技术方案是：基于不对称RPA的CRISPR/Cas12a检测试剂盒，包括不对称RPA体系和CRISPR/Cas12a体系，所述不对称RPA体系中包括限制引物F和过量引物R，限制引物F的浓度：过量引物R的浓度为1:5～1:15。
[0008]所述限制引物F的浓度：过量引物R最优的浓度为1:10μM。
[0009]为了实现第二个目的，本专利技术采用的技术方案是：检测牛结节性皮肤病病毒试剂盒，包括核苷酸序列为SEQ ID NO.1的LSDV限制引物F，核苷酸序列为SEQ ID NO.2的LSDV过量引物R，核苷酸序列为SEQ ID NO.3的LSDV
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...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于不对称RPA的CRISPR/Cas12a检测试剂盒，包括Asy
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RPA体系和CRISPR/Cas12a体系，其特征在于：所述不对称RPA体系中包括限制引物F和过量引物R，限制引物F的浓度：过量引物R的浓度为1:5～1:15。2.根据权利要求1所述基于不对称RPA的CRISPR/Cas12a检测试剂盒，其特征在于：所述限制引物F的浓度：过量引物R的浓度为1:10。3.利用权利要求1或2所述不对称RPA的CRISPR/Cas12a检测试剂盒制备的检测牛结节性皮肤病病毒试剂盒，其特征在于：包括核苷酸序列为SEQ ID NO.1的LSDV限制引物F，核苷酸序列为SEQ ID NO.2的LSDV过量引物R，核苷酸序列为SEQ ID NO.3的LSDV
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crRNA，核苷酸序列为SEQ ID NO.4的LSDV
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ssDNA reporter。4.根据权利要求3所述检测牛结节性皮肤病病毒试剂盒，其特征在于：Asy
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RPA体系包括2μL待测核酸，2μL 1μM LSDV限制引物F，2μL 10μMLSDV过量引物R，一管冻干粉，20μL溶解剂，20μL ddH2O和2.5μL激活剂；CRISPR/Cas12a体系包括2μL 1μM的Cas12a、2μL 1μM的LSDV
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crRNA、1μL 10μM的ssDNA reporter和1
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的反应缓冲液。5.根据权利要求4所述检测牛结节性皮肤病病毒试剂盒，其特征在于：所述Asy
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RPA体系加载在PCR试管的底部，所述CRISPR/Cas12a体系放置在试管盖上。6.根据权利要求4或5所述检测牛结节性皮肤病病毒试剂盒，其特征在于：所述CRISPR/Cas12a体系有信号为LSDV阳性样本，没有信号为阴性样本。7.利用权利要求1或2所述不对称RPA的CRISPR/Cas12a检测试剂盒制备的区分耐利福平和野生型结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于：包括核苷酸序列为SEQ ID NO.5的TB限制引物F，核苷酸序列为SEQ ID NO.6的TB过量引物R，核苷酸序列为SEQ ID NO.7的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨俊，聂福平，曹改花，李应国，侯长军，王国民，史梅梅，霍丹群，
申请(专利权)人：重庆海关技术中心，
类型：发明
国别省市：