用于检测猪伪狂犬病病毒的多重PCR引物、检测方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于检测猪伪狂犬病病毒的多重PCR引物、检测方法和应用，涉及医学检验技术领域。其中，所述引物包括3组引物组合，具体引物序列如下：PRV

【技术实现步骤摘要】
用于检测猪伪狂犬病病毒的多重PCR引物、检测方法和应用


[0001]本专利技术涉及医学检验
，具体涉及一种用于检测猪伪狂犬病病毒的多重PCR引物、检测方法和应用。

技术介绍

[0002]伪狂犬病(PRV)又名奥耶兹基氏病或阿氏病是由伪狂犬病毒引起的多种家畜、野生动物、伴侣动物和实验动物的一种急性传染病。猪是PRV的天然宿主，但它也会感染各种家畜和野生动物，如牛、羊、狗、猫和其他脊椎动物。猪伪狂犬病是影响生猪生产的重要疾病，仔猪患病后会出现神经症状和腹泻的症状。猪伪狂犬病会导致母猪繁殖障碍，如流产、死产、木乃伊胎及呼吸系统症状，给生猪养殖业猪业带来巨大的经济损失。
[0003]PCR技术以其灵敏、稳定、快速等优点在分子领域中被广泛应。尤其针对疾病诊断方面，具有同时检测多种病原的多重PCR技术，更是在临床检测工作中发挥重要作用。目前我国养殖业针对PRV普遍采取的是以疫苗防控为主的措施，目前世面上较为常用的猪伪狂犬活疫苗分为以下几种：猪伪狂犬病活疫苗(C株)、猪伪狂犬病活疫苗(Bucharest株)、猪伪狂犬病耐热保护剂活疫苗、(HB2000株)猪伪狂犬病活疫苗SA215株、猪伪狂犬病活疫苗HB
‑
98株。在这样的背景下，一些弱毒苗或是基因缺失苗出现疫苗株感染的情况频频发生，而在诊断时通常能发现是由PRV病毒感染所致，但毒株来源不详，因此对疾病的预防控制造成了一定的麻烦。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供的一种用于检测猪伪狂犬病病毒的多重PCR引物、检测方法和应用，旨在解决上述
技术介绍
中存在的问题。
[0005]为了实现上述技术目的，本专利技术主要采用如下技术方案：
[0006]第一方面，本专利技术公开了一种用于检测猪伪狂犬病病毒的多重PCR引物，其中，所述引物包括3组引物组合，具体引物序列如下：
[0007]上游引物PRV
‑
TK
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1F：ACTCTGTTCGACACGGACAC，如SEQ ID NO:1所示；
[0008]下游引物PRV
‑
TK
‑
1R：CTGATGTCCCCGACGATGAAG，如SEQ ID NO:2所示；
[0009]上游引物PRV
‑
gG
‑
2F：CGACTACGCCGACTACTACG，如SEQ ID NO:3所示；
[0010]下游引物PRV
‑
gG
‑
2R：CGAAGATGTCAGAGGGCGAG，如SEQ ID NO:4所示；
[0011]上游引物PRV
‑
gE
‑
引物1F：TCTGCGTGCTGTGCTCCC，如SEQ ID NO:5所示；
[0012]下游引物PRV
‑
gE
‑
引物1R：GTCCATTCGTCACTTCCG，如SEQ ID NO:6所示。
[0013]其中，gG糖蛋白会被大量产生，在伪狂犬病毒感染宿主细胞时，然后分泌到培养基之外。TK基因全长约为1kb，是PRV的主要毒力基因之一，与PRV的神经致病力有关。TK基因主要编码胸苷激酶，其功能主要与调控病毒的核酸代谢相关。糖蛋白gE基因是PRV的主要毒力基因，gE基因编码的蛋白质在介导病毒进入融合、病毒颗粒释放和病毒神经营养活性方面起重要作用。具有gE基因缺失的PRV保持了免疫原性，但显着降低了毒力，其对应编码的蛋
白与病毒毒力及病毒的生长复制息息相关。
[0014]第二方面，本专利技术公开了一种用于检测猪伪狂犬病病毒的试剂盒，所述试剂盒含有如第一方面1所述的多重PCR引物。
[0015]第三方面，本专利技术公开了一种如第二方面所述的试剂盒在检测猪伪狂犬病病毒中的应用。
[0016]进一步的，在检测疫苗株感染或野毒株感染的猪伪狂犬病病毒中的应用。
[0017]第四方面，本专利技术公开了一种检测猪伪狂犬病病毒的方法，包括如下步骤：
[0018](1)提取待检组织样品的DNA；
[0019](2)以步骤(1)的DNA为模板，利用如第一方面所述的多重PCR引物，进行多重PCR扩增，
[0020](3)根据多重PCR扩增产物电泳结果，判断样品是否携带猪伪狂犬病病毒。
[0021]在本专利技术的较佳实施方式中，步骤(2)中，多重PCR的25μL反应体系为：3组上游引物、3组下游引物各0.5μL，2
×
TaqMaster Mix 10μL，模板5.0μL，最后用ddH2O补齐至25μL；
[0022]多重PCR反应条件:94℃
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5min；94℃
‑
30s；57℃
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30s；72℃
‑
50s；30个循环；最后72℃延伸7min。
[0023]在本专利技术的较佳实施方式中，所述多重PCR反应条件通过如下方法确定：
[0024](1)分别确定含有TK、gG或gE基因的质粒进行单重PCR最佳扩增条件；
[0025](2)将步骤(1)分别得到的最佳扩增条件进行组合优化，得到多重PCR反应条件。
[0026]进一步的，步骤(1)中，含有TK基因的质粒进行单重PCR最佳扩增条件为：95℃
‑
5min；95℃
‑
60s，65
‑
55℃
‑
30s，72℃
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1min，35个循环；最后72℃
‑
10min；含有gG或gE基因的质粒进行单重PCR最佳扩增条件为：95℃
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3min；95℃
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30s，61
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55℃
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30s，72℃
‑
1min，34个循环；最后72℃
‑
10min。
[0027]第五方面，本专利技术公开了一种如第四方面所述的检测猪伪狂犬病病毒的方法在检测疫苗株感染或野毒株感染的猪伪狂犬病病毒中的应用。
[0028]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0029]本专利技术所建立的多重PCR检测方法能特异性扩增gE
‑
引物(342bp)、gG
‑
引物(446bp)和TK
‑
引物(269bp)三种基因的目的片段，可以用于特异性检测猪伪狂犬病病毒；
[0030]本专利技术所建立的多重PCR检测方法对基因gE、TK、gG的最低检测限分别为：6.67
×
104、8.50
×
104、5.10
×
104copies/μL，检测灵敏度高；
[0031]本专利技术所建立的多重PCR检测方法能检测猪伪狂犬病病毒是由野毒株还是疫苗株感染，能确定毒株来源，有利于诊断及疾病的预防。
附图说明
[0032]图1为TK基因单重PCR电泳本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测猪伪狂犬病病毒的多重PCR引物，其特征在于，其中，所述引物包括3组引物组合，具体引物序列如下：上游引物PRV
‑
TK
‑
1F：ACTCTGTTCGACACGGACAC，如SEQ ID NO:1所示；下游引物PRV
‑
TK
‑
1R：CTGATGTCCCCGACGATGAAG，如SEQ ID NO:2所示；上游引物PRV
‑
gG
‑
2F：CGACTACGCCGACTACTACG，如SEQ ID NO:3所示；下游引物PRV
‑
gG
‑
2R：CGAAGATGTCAGAGGGCGAG，如SEQ ID NO:4所示；上游引物PRV
‑
gE
‑
引物1F：TCTGCGTGCTGTGCTCCC，如SEQ ID NO:5所示；下游引物PRV
‑
gE
‑
引物1R：GTCCATTCGTCACTTCCG，如SEQ ID NO:6所示。2.一种用于检测猪伪狂犬病病毒的试剂盒，其特征在于：含有如权利要求1所述的多重PCR引物。3.如权利要求2所述的试剂盒在检测猪伪狂犬病病毒中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：检测疫苗株感染或野毒株感染的猪伪狂犬病病毒中的应用。5.一种检测猪伪狂犬病病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取待检组织样品的DNA；(2)以步骤(1)的DNA为模板，利用如权利要求1所述的多重PCR引物，进行多重PCR扩增，(3)根据多重PCR扩增产物电泳结果，判断样品是否携带猪伪狂犬病病毒。6.根据权利要求5所述的检...

【专利技术属性】
技术研发人员：张付贤，雷连成，吴晓敏，李华明，徐梦然，戴璐，
申请(专利权)人：长江大学，
类型：发明
国别省市：