非洲猪瘟病毒检测引物组合物、试纸条、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种非洲猪瘟病毒检测引物组合物、试纸条、试剂盒及方法。所述的非洲猪瘟病毒的检测引物组合物，包括如SEQIDNO.1所示的正向外引物、SEQIDNO.2所示的反向外引物、SEQIDNO.3所示的正向内引物、SEQIDNO.4所示的反向内引物和SEQIDNO.5所示的反向环引物。本发明专利技术的目的是提供一种非洲猪瘟病毒快速检测试纸条和试剂盒，能够低成本、快速、精确度高地定量检测非洲猪瘟病毒。定量检测非洲猪瘟病毒。定量检测非洲猪瘟病毒。

【技术实现步骤摘要】
非洲猪瘟病毒检测引物组合物、试纸条、试剂盒及方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，特别是涉及一种非洲猪瘟病毒检测引物组合物、试纸条、试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种高度接触性传染病，强毒株感染后导致动物100％的死亡率。非洲猪瘟病毒是一种大的、有囊膜的双链DNA病毒，是最新命名的非洲猪瘟病毒科的唯一成员,也是唯一的虫媒DNA病毒，大小170kb～190kb，直径172～220nm，平均直径为200nm，衣壳为二十面体对称，形似六角形，病毒颗粒具多层衣壳，整个基因组含有151个ORF，编码多种病毒结构蛋白，这些蛋白大都与病毒吸附、毒力、细胞凋亡、宿主范围及免疫应答相关。p72蛋白是B646L基因编码的主要核衣壳蛋白，片段极为保守，且不同株间差异很小，常作为病毒检测靶标。由于目前该病毒引发的疫情尚无可行疫苗及治疗手段，因此，一旦出现疫情，隔离扑杀是防治疫情扩散最简单且强有力的手段，但同时也给我国养猪行业带来前所未有的打击，因此建立一种快速高效检测非洲猪瘟病毒的实验室诊断方法显得非常重要。
[0003]常规的检测方法如红细胞吸附试验(hemadsorption test,HAD)、免疫吸附试验(immunosorbent assay,ELISA)和荧光抗体试验(fluorescent antibody test,FAT)，具有较高的灵敏度，但是这些方法费时费力，限制了其使用推广；聚合酶链式反应(PCR法)如传统PCR、荧光定量PCR、数字PCR等以核酸为检测对象的检测方法具有灵敏度高、适用样品类型多的优点，但这些方法仍存在检测成本高、耗时长、易污染等不足之处，且不适用于大量样本现场快速检测；以胶体金为标记物的免疫层析法，灵敏度较低，只能定性或半定量检测。
[0004]环介导等温扩增技术(LAMP)作为一种新型的检测技术，其特异性高，灵敏度高，通常能检测到10拷贝数以下的模板量，快速高效，成本低廉、操作简便，是一种适用于野外现场和基层的检测技术。同时结合侧流核酸层析技术(LFCA)，将LAMP产物在侧向流动试纸条上以条带的方式呈现，通过荧光读取仪监测的荧光强度就可完成结果判断，摆脱了对于精密仪器的依赖性，摒弃了有毒试剂，使得结果更加特异，而且整个检测时程也仅在LAMP反应的基础上增加5
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10min，不仅操作简单快速、价格低廉、灵敏度高，还可实现现场的快速检测。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种非洲猪瘟病毒快速检测试纸条和试剂盒，能够低成本、快速、精确度高地定量检测非洲猪瘟病毒。
[0006]一种非洲猪瘟病毒的检测引物组合物，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1所示的正向外引物、SEQ ID NO.2所示的反向外引物、SEQ ID NO.3所示的正向内引物、SEQ ID NO.4所示的反向内引物和SEQ ID NO.5所示的反向环引物。
[0007]在其中一个实施例中，所述正向内引物的5
’
端标记6
‑
FAM抗体；所述反向环引物的3
’
端标记Biotin。
[0008]在其中一个实施例中，
[0009]所述正向外引物的引物序列如下：
[0010]F3：TACAGTTCTTCGAGAGGC；
[0011]所述反向外引物的引物序列如下：
[0012]B3：TAAACATCATCGCACGCG；
[0013]所述正向内引物的引物序列如下：
[0014]FIP：CATGAGCAGTTACGGAATTGTTTATTGTTCATCTATATCTGATATTAGCC，5
’
端标记6
‑
FAM抗体；
[0015]所述反向内引物的引物序列如下：
[0016]BIP：AATTTCCATCATAGTTCTGCAGCTTGTAATCGCATTGCCTCC；
[0017]所述反向环引物的引物序列如下：
[0018]LB：CTTACATACCCTGCCACTAC，3
’
端标记Biotin。
[0019]一种非洲猪瘟病毒检测试纸条，包括：样品垫、结合垫、检测膜、吸收垫以及底板，所述样品垫、所述结合垫、所述检测膜以及所述吸收垫在所述底板的一端至另一端依次连接；所述结合垫上含有荧光微球标记的6
‑
FAM抗体，所述检测膜上包被有链霉亲和素的检测线以及包被有羊抗鼠IgG抗体的质控线。
[0020]在其中一个实施例中，所述荧光微球标记的6
‑
FAM抗体的制备步骤如下：
[0021]将荧光微球加入活化缓冲液中洗涤，分别加入5μL～40μLEDC/NHS活化剂进行活化20min～40min，洗涤，15000
×
g～21000
×
g离心8min～15min；
[0022]将荧光微球用偶联缓冲液复溶，加入6
‑
FAM抗体进行超声偶联10min～90min，所述6
‑
FAM抗体与所述荧光微球在所述偶联缓冲液中固含量为0.5％～2.0％；
[0023]加入封闭液进行封闭5min～30min，15000
×
g～21000
×
g离心8min～15min，去除上清液；
[0024]加入300μL～500μL的保存液洗涤重悬2次，所述荧光微球均匀分散在保存液中，4℃避光保存。
[0025]在其中一个实施例中，所述结合垫的制备步骤包括：将制备获得的所述荧光微球标记的6
‑
FAM抗体溶液喷点于结合垫，将结合垫在35℃～45℃干燥12小时～48小时。
[0026]在其中一个实施例中，所述检测膜的制备步骤包括：使用包被液稀释制备获得链霉亲和素溶液，使用包被液稀释制备获得羊抗鼠IgG抗体溶液；
[0027]在其中一个实施例中，将制备获得包含链霉亲和素的溶液以及制备获得包含羊抗鼠IgG抗体的溶液分别划线于所述检测膜，将检测膜在35℃～45℃干燥12小时～48小时，制备获得所述检测线和所述质控线。
[0028]在其中一个实施例中，所述结合垫选自玻璃纤维膜或聚酯膜。
[0029]在其中一个实施例中，所述检测膜选自硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
[0030]在其中一个实施例中，所述底板为PVC底板或其他硬质不吸水的材料底板。
[0031]在其中一个实施例中，所述检测膜上从所述样品垫至所述吸收垫一端，依次为所述检测线以及所述质控线。
[0032]在其中一个实施例中，所述检测线和所述质控线的间隔为2.0mm～10.0mm。
[0033]在其中一个实施例中，所述链霉亲和素的包被量为0.4μL/cm膜～1.2μL/cm膜。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒的检测引物组合物，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1所示的正向外引物、SEQ ID NO.2所示的反向外引物、SEQ ID NO.3所示的正向内引物、SEQ ID NO.4所示的反向内引物和SEQ ID NO.5所示的反向环引物。2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒的检测引物组合物，其特征在于，所述正向内引物的5
’
端标记6
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FAM抗体；所述反向环引物的3
’
端标记Biotin。3.一种非洲猪瘟病毒检测试纸条，其特征在于，包括：样品垫(2)、结合垫(3)、检测膜(4)、吸收垫(7)以及底板(1)，所述样品垫(2)、所述结合垫(3)、所述检测膜(4)以及所述吸收垫(7)在所述底板(1)的一端至另一端依次连接；所述结合垫(3)上含有荧光微球标记的6
‑
FAM抗体，所述检测膜(4)上包被有链霉亲和素的检测线(5)以及包被有羊抗鼠IgG抗体的质控线(6)。4.根据权利要求3所述的非洲猪瘟病毒检测试纸条，其特征在于，所述荧光微球标记的6
‑
FAM抗体的制备步骤如下：将荧光微球加入活化缓冲液中洗涤，加入EDC/NHS活化剂进行活化20min～40min，洗涤，15000
×
g～21000
×
g离心8min～15min；将荧光微球用偶联缓冲液复溶，加入6
‑
FAM抗体进行超声偶联10min～90min，所述6
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FAM抗体与所述荧光微球在所述偶联缓冲液中固含量为0.5％～2.0％；加入封闭液进行封闭5min～30min，15000
×
g～21000
×
g离心8
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15min去除上清液；加入300μL～500μL的保存液洗涤重悬2次，所述荧光微球均匀分散在保存液中，4℃避光保存。5.根据权利要求4所述的非洲猪瘟病毒检测试纸条，其特征在于，所述结合垫(3)的制备步骤包括：将制备获得的所述荧光微球标记的6
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FAM抗体溶液喷点于结合垫(3)，将结合垫(3)在35℃～45℃干燥12小时～48小时；和/或所述检测膜(4)的制备步骤包括：使用包被液稀释制备获得链霉亲和素溶液，使用包被液稀释制备获得羊抗鼠IgG抗体溶液；将制备获得包含链霉亲和素的溶液以及制备获得包含羊抗鼠IgG抗体的溶液分别划线于所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭有将，邵洁，梁德智，漆彦斌，黄子珊，张国芬，江海婷，林丽，文媛怡，
申请(专利权)人：佛山墨赛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：