一种呼吸道病毒多联检核酸快速检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种呼吸道病毒多联检核酸快速检测方法及试剂盒，属于病原体检测技术领域。本发明专利技术筛选分析来自世界各地的上千个甲、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒基因组，设计可兼容甲型流感病毒H1N1&H3N2、乙型流感病毒Y&V系、呼吸道合胞病毒A&B亚型、腺病毒B&E亚属的特异性引物探针序列，通过调试RAPID反应，实现引入人源内参(控制采样准确性)与病原同时检测的多联检检测体系，通过结合同时检测三种分子标记的胶体金侧向流试纸条，实现单一反应多联检扩增后产物的可视化检测。反应多联检扩增后产物的可视化检测。反应多联检扩增后产物的可视化检测。

【技术实现步骤摘要】
一种呼吸道病毒多联检核酸快速检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种呼吸道病毒多联检核酸快速检测方法及试剂盒，属于病原体检测


技术介绍

[0002]人流行性感冒病毒(human influenza virus)属于正粘病毒科，为单股、负链、分节段RNA病毒。根据核蛋白和基质蛋白，分为甲乙丙丁四型，甲型和乙型流感病毒可传播并引起季节性流行性疾病。丙型流感病毒检出率较低，通常导致轻度感染，因此对公共卫生影响较小。丁型流感病毒主要感染牛。甲型流感病毒根据病毒表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的组合情况，甲型流感病毒进一步分类为亚型。目前正在人际间传播的甲型流感病毒是甲型H1N1和甲型H3N2流感亚型。乙型流感病毒无亚型之分，而分为两个系。目前流行的乙型流感病毒属于乙型Yamagata系或乙型Victoria系。
[0003]呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)属于肺炎病毒科，正肺病毒属，有包膜，是非节段性、单股负链RNA病毒。HRSV只有1个血清型，根据抗原性分为两大亚型：A型和B型，不同亚型的主要结构蛋白有明显差异。
[0004]腺病毒(Adenovirus)是直径约90nm的无包膜二十面体DNA病毒，DNA核心部分由长约36kb，属于腺病毒科。人类腺病毒分为A～G共7个亚属，56个血清型；与呼吸道感染有关的是B、C和E亚属，其中B亚属HAdV
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7和HSdV
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3是引起我国呼吸道感染性疾病主要的腺病毒型别。与胃肠道感染有关的是A、F和G亚属，与眼部感染有关的是D和E亚属，与肾脏及尿道感染有关的是D和E亚属。
[0005]重组酶等温扩增检测(Recombinase AmPlification Isothermal Detection，RAPID)技术技术，是一种等温核酸扩增技术，可在等温条件下(30℃
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45℃，一般为37℃
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42℃)，5
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20min内，即可实现对目的核酸片段的扩增，是模拟生物体内核酸复制机制，采用基因工程改造的重组酶和聚合酶，结合单链结合蛋白及辅助蛋白，实现对核酸的等温扩增。其技术关键在于引物的设计。现有的PCR扩增引物多半是不适用的，因为RAPID引物比PCR引物要长，通常需要达到30
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38个碱基。并且，在设计RAPID引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。RAPID的引物设计不像传统PCR那样成熟，这就需要进行引物的设计和优化。由于RAPID技术通常在等温条件下进行，使得其无法如普通PCR扩增通过调节反应时的退火温度和降温速率来避免多重检测时不同呼吸道病原引物组之间T
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值差异和扩增效率的不同所带来的多种扩增产物之间的互相干扰，也使得获得适合多重检测用的、高特异性的RAPID扩增引物的难度非常大。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是：开发一种面向甲、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒的RAPID检测试剂盒及方法。
[0007]一种用于重组酶等温扩增检测的引物组，其中包含有用于扩增甲、乙型流感病毒、
呼吸道合胞病毒和/或腺病毒的靶标区域的引物对，具体包括有：
[0008]用于扩增甲型流感病毒的靶标区域的引物对，其核苷酸序列分别是：
[0009]TCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCGCAG；
[0010]CAAAGCGTCTACGCTGCAGTCCTCGCTCACT；
[0011]用于扩增乙型流感病毒的靶标区域的引物对，其核苷酸序列分别是：
[0012]AATGCTCAGTAATTGTCCACCAGGAGGGATCAG；
[0013]GGCTGTCTCTGGTTATTCTTTCAGTCATAGCCA；
[0014]用于扩增呼吸道合胞病毒的靶标区域的引物对，其核苷酸序列分别是：
[0015]ACATTTGATAACAATGAAGAAGAATCTAGC；
[0016]TTCTATCATTTCTTCTCTTAGACCAACCAT；
[0017]用于扩增腺病毒的靶标区域的引物对，其核苷酸序列分别是：
[0018]CGGATCTTTCCAACCCTGTATGCCATCTTCCAG；
[0019]GTACTTGTTGAAGAGAGCCTCGGCGTCCTCAAG。
[0020]所述的引物组中还包括对人源内参RNase P进行扩增的引物对，其核苷酸序列分别是：
[0021]TCCACATCCGAGTCTTCAGGGTCACACCCAA；
[0022]ATATGGCAATAGTTACAGACCGCATACACAC。
[0023]一种用于检测呼吸道病毒的试剂盒，其中包括有上述的引物组。
[0024]其中还包括有：
[0025]用于特异性显示甲型流感病毒的探针，其核苷酸序列是：
[0026]5'FAM
‑
GATCTTGAGGCTCTCATGGAATGGCTAAAGACA/idSp/GACCAATCTTGTCACCT
‑
C3Spacer；
[0027]用于特异性显示乙型流感病毒的探针，其核苷酸序列是：
[0028]5'TAMRA
‑
ATGACTGTGACAGGAGACAATACTAAATGGAAT/idSp/AATGCTTAAATCCAAG
‑
C3Spacer；
[0029]用于特异性显示呼吸道合胞病毒的探针，其核苷酸序列是：
[0030]5'TAMRA
‑
GATAATATAACAGCAAGATTAGATAGGATTGATGA/idSp/AAATTAAGTGAAATA
‑
C3Spacer；
[0031]用于特异性显示腺病毒的探针，其核苷酸序列是：
[0032]5'FAM
‑
TCGCTCACCAGAAGTTGTTTGTATCACAAGAGC/idSp/AAGATCAACTTCAGCGC
‑
C3Spacer；
[0033]用于特异性显示人源内参RNase P的探针，其核苷酸序列是：
[0034]5'DIG
‑
TCCGTGATATGGCTCTTCGCATGCTGAGTACTGG/idSp/CCTCGGACCAGAGCCA
‑
C3Spacer。
[0035]分子靶标在用于制备甲流、乙流、呼吸道合胞病毒和/或腺病毒的试剂中的应用；所述的分子靶标分别具有如SEQ ID NO.1
‑
5中任一所示的核苷酸序列。
[0036]一种检测甲、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和/或腺病毒的方法，包括如下步骤：
[0037]将样本进行重组酶等温扩增反应，反应过程中将用于扩增甲本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于重组酶等温扩增检测的引物组，其特征在于，其中包含有用于扩增甲、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和/或腺病毒的靶标区域的引物对，具体包括有：用于扩增甲型流感病毒的靶标区域的引物对，其核苷酸序列分别是：TCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCGCAG；CAAAGCGTCTACGCTGCAGTCCTCGCTCACT；用于扩增乙型流感病毒的靶标区域的引物对，其核苷酸序列分别是：AATGCTCAGTAATTGTCCACCAGGAGGGATCAG；GGCTGTCTCTGGTTATTCTTTCAGTCATAGCCA；用于扩增呼吸道合胞病毒的靶标区域的引物对，其核苷酸序列分别是：ACATTTGATAACAATGAAGAAGAATCTAGC；TTCTATCATTTCTTCTCTTAGACCAACCAT；用于扩增腺病毒的靶标区域的引物对，其核苷酸序列分别是：CGGATCTTTCCAACCCTGTATGCCATCTTCCAG；GTACTTGTTGAAGAGAGCCTCGGCGTCCTCAAG。2.根据权利要求1所述的用于重组酶等温扩增检测的引物组，其特征在于，所述的引物组中还包括对人源内参RNase P进行扩增的引物对，其核苷酸序列分别是：TCCACATCCGAGTCTTCAGGGTCACACCCAA；ATATGGCAATAGTTACAGACCGCATACACAC。3.一种用于检测呼吸道病毒的试剂盒，其特征在于，其中包括有上述的引物组。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，其中还包括有：用于特异性显示甲型流感病毒的探针，其核苷酸序列是：5'FAM
‑
GATCTTGAGGCTCTCATGGAATGGCTAAAGACA/idSp/GACCAATCTTGTCACCT
‑
C3Spacer；用于特异性显示乙型流感病毒的探针，其核苷酸序列是：5'TAMRA
‑
ATGACTGTGACAGGAGACAATACTAAATGGAAT/idSp/AATGCTTAAATCCAAG
‑
C3Spacer；用于特异性显示呼...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵阳，贤丽曼，梁相志，张嫚嫚，刘思思，杨振，
申请(专利权)人：迪飞医学科技南京有限公司，
类型：发明
国别省市：