检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的RAA-CRISPR核酸分子组合物及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及生物技术和生物检测领域，具体为检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的RAA

【技术实现步骤摘要】
检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的RAA
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CRISPR核酸分子组合物及试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物技术和生物检测领域，具体为检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的RAA
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CRISPR核酸分子组合物及试剂盒和应用。

技术介绍

[0002]IHHNV(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒)是凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)主要的病原之一。IHHNV宿主谱较广，包括凡纳滨对虾、斑节对虾(Penaeus monodon)、日本沼虾(Macrobrachium nipponensis)、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、宽沟对虾(Penaeus latisulcatus)等。
[0003]IHHNV分类为小病毒目Piccovirales，短浓核症病毒属Brevidensovirus)(Lightner,2011)细小病毒科Parvoviridae中的一种。该病毒又称细角滨对虾浓核病毒(Penaeus stylirostris densovirus,PstDNV)，病毒粒子约为20
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22nm，无囊膜，单链线性二十面体结构，长度约为3.9kb，包含3个开放阅读框(Lightner,2011)，是目前已知的最小的对虾病毒。
[0004]IHHNV对对虾仔虾的危害较大。仔虾感染该病毒后，会出现生长缓慢，以及表皮崎形引起的触角鞭毛皱起、额剑弯曲、表皮粗糙或残缺、腹部甲壳病变、尾节弯曲，还有规格参差不齐等症状，称为慢性矮小残缺综合征(runt deformity syndrome,RDS)，对养殖业造成较大的经济损失。《2021中国水生动物卫生状况报告》(中国农业出版社)数据指出，“2020年中国凡纳滨对虾因病损失约60.0亿元，监测养殖场点492个其中阳性场44个，基于多地仍存在一定阳性检出率，需要继续重视进口亲虾和苗种带来的病毒引入风险”。世界动物卫生组织(WOAH)将IHHNV引起的疾病列入虾类重要疫病名录，WOAH同时指出该病毒尚未有商品化的疫苗和药物产品应用于防控，开展病原检测，并及时对带病苗种进行净化或清除是最有效的病毒防控手段之一。
[0005]现有的病原检测方法主要包括常规病理学技术，利用病理切片结合透射电子显微镜等技术对样本开展检测，该类型技术由于实验操作流程耗时较长，对技术人员要求高，需要成本较高的配套仪器和研究平台，通常适用于科研级别的研究类型实验。
[0006]基于免疫学和分子生物学方法建立的快速现场检测方案是目前病原检测主流的现场检测技术。基于免疫学的有胶体金检测试纸条、酶联免疫吸附实验(ELISA)等技术。基于核酸扩增的检测方案如定量PCR、PCR、LAMP和RPA等技术均可以较快速的开展病原检测，其中胶体金检测试纸条检测技术、LAMP和RPA等技术因为不需要变温扩增仪器(如PCR仪器、定量PCR仪器)，同时可以利用颜色反应或恒温扩增仪器(如普通水浴锅、专用恒温扩增仪器等)更适用于农业一线和条件相对简单的基层养殖场开展相应工作。
[0007]例如，对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)检测PCR法(国标GB/T 25878
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2010)，采用常规PCR检测法扩增目标序列389bp(GenBank:KF907321.1)。该方法只能检测单
一病原。PCR是变温反应，需要用到专用的PCR仪器，检测过程需要3
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4小时，DNA提取约1h，加样约3min/样品，PCR反应约1.5h，跑胶0.5h。
[0008]荧光定量PCR检测法需要荧光定量PCR仪器，质粒DNA(浓度为5.2
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10
10
copies/μL)，质粒检测限为5copies/μL；检测全过程约2
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3小时：DNA提取约1h，加样约3min/样品，定量PCR反应约1.5h；为变温反应，并且需要特定的上下游引物及探针系列。
[0009]多重PCR单链扩增技术结合生物芯片检测技术为变温反应，检测限10～100copies/μL，全过程约2.5小时：DNA提取约1h，加样约3min/样品，PCR反应约1h，生物芯片检测反应约0.5h。
[0010]重组酶聚合酶扩增(RPA)为恒温反应，全过程约1小时。DNA提取约1h，加样约3min/样品，RPA反应约15min。
[0011]环介导等温扩增(LAMP)技术方法，全过程约2小时。DNA提取约1h，加样约3min/样品，LAMP检测方法在63℃恒温条件1h内完成反应。直接观察颜色变化。利用等温加热仪器或专用等温反应仪，最低检测限10.3copies/μL。
[0012]重组酶介导链替换核酸扩增技术(RAA)法主要使用3种酶：重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶。重组酶与引物结合形成复合体，在单链DNA结合蛋白的辅助下，模板DNA解链并使引物与模板配对，然后在DNA聚合酶的作用下，生成新的DNA链。经过几十个循环后，DNA新链的数量以指数级增长。RAA法用酶的作用使双链DNA解链。因此反应条件较温和，不需要高温使模板DNA变性。RAA反应的时间也较短，在15～30min就可以得到能检测到的扩增片段。重组酶介导扩增(RAA技术)相较于重组酶聚合酶扩增(RPA技术)的技术改进在于：(1)RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物聚合体；RPA使用的重组酶是T4 UVSX，来自于病毒。实验证明，来自于细菌和真菌的重组酶能与DNA紧密结合，使核酸体外扩增反应顺利进行。(2)RAA使用的聚合酶只具有DNA聚合酶活性，反应产物呈指数级增长；RPA的聚合酶具有链置换活性和聚合酶活性，反应产物不呈指数增长。
[0013]Cas12a可用于编辑目标DNA。该蛋白最初被称为Cpf1，由张锋团队在其2015年的cell论文中首次提出。Cas12a(Cpf1)是基因编辑酶家族的重要一员，能够在Cas9不能作用的位置切割DNA；Cas12a与crRNA以及靶标DNA形成三元复合物时，该复合物会表现出很强的反式核酸酶活性活性，可将体系中非靶标单链DNA切成几个碱基长度的“碎片”。利用这一特性，Doudna教授团队开发出一种被称为“DETECTR”(DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter)的诊断系统，该系统由CRISPR
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Cas12a(Cpf1)和向导RNA、荧光报告分子及RAA(recombinase polymerase amplification)等温扩增试剂组成，单管反应即可对临床样本中的少量DNA进行快速、简便地即时检测。当加热到一定温度时，RAA扩增目标DNA，使Cas12a(Cpf1)更容易本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的RAA
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CRISPR核酸分子组合物，其特征在于，包括以下核苷酸：(1)扩增引物对，含有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；(2)crRNA，含有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的核酸分子组合物，其特征在于，所述扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。3.一种检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述核酸分子组合物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包含信号报告探针，所述的信号报告探针与权利要求1或2所述核酸分子组合物的crRNA互补结合。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的信号报告探针5
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端用荧光报告基团标记，3
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端用荧光淬灭基团标记。6.根据权利要求3或4所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王浩，徐伟，尹纪元，丁兆阳，李鹏飞，吕利群，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：