超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒，用于灵敏地检测牛结节性皮肤病病毒。首先基于RoomTemp Sample Lysis Kit在室温下快速裂解样品，释放核酸，无需核酸提取纯化直接用于qPCR。方法集核酸提取、扩增和检测于一体。这大大简化了样品处理，节省了成本和时间。超快速qPCR在15分50秒内实现40个循环，检出限低至2.5

【技术实现步骤摘要】
超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒


[0001]本专利技术属于生物病毒检测领域，具体涉及一种Ultra
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fast qPCR和CRISPR/Cas12a系统以及横向流动试纸条技术的检测方法。

技术介绍

[0002]聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术是医学诊断、病毒细菌检测、环境监测、食品安全等方面的主要方法。然而，PCR通常需要一个多小时来扩增纯化的核酸。酶的三步扩增速度和PCR装置的变温速率导致PCR时间较长。然而，对于一种便于现场检测的稳定和温度变化快的超快速PCR装置，尚缺乏系统的分析研究。近年来，为了克服加热效率低和便携性差的问题，开发了一些小型化PCR系统，即微流控芯片的芯片实验室技术。仪器的进步加速了超快速PCR的发展。Byounghee Kim开发了一种超快速定量聚合酶链反应(PCR)，用于特异性检测慢性蜜蜂麻痹病毒(CBPV)。1.0
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108分子通过SYBR Green在4min和17s内检测到，通过EvaGreen1.0
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102分子可以在11min和16s内检测到。对两个转基因马铃薯事件(SPS
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Y9和EH92
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1)建立了超快速PCR(UF
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PCR)系统。它可以检测到低至0.5％的转基因掺入。采用超快速PCR技术快速检测加工食品中荞麦过敏原DNA。该方法的检出限为小麦中荞麦的0.001％。利用特异、灵敏的超快速PCR方法可以快速、准确地鉴定商品食品中的6种昆虫，检出限为1pg。以上证明了超快速PCR在食品、病毒、病原体和疾病的检测中有着广泛的应用。虽然扩增阶段所需的时间较少，但这些方法仍然需要耗时且昂贵的核酸提取。这对超快速PCR的应用是非常不利的。此外，为了快速得到结果，采用SYBR green和evgreen等荧光染料输出信号。它们的特异性较低，因为它们无法避免引物二聚体和非特异性扩增的假阳性。因此需要引入更特异的方法。
[0003]CRISPR/Cas12a系统是在细菌免疫系统中发现的，已广泛应用于核酸检测、蛋白质检测和小分子检测。当CRISPR/Cas12a与互补DNA结合时，可激活crRNA的顺式切割和反式切割活性。其中，顺式切割活性切割互补DNA，而反式切割活性切割任意单链DNA。研究表明其反裂解活性可达17s
‑1。因此，CRISPR/Cas12a系统不仅对依赖的crRNA具有高特异性，而且对依赖于其横切活性的crRNA具有高敏感性。先前的研究发现，与单独的扩增技术相比，CRISPR/Cas12a的参与可以将灵敏度提高高达100倍。这为检测低丰度样品提供了一种灵敏的方法。
[0004]引起牛结节性皮肤病的牛结节性皮肤病病毒(LSDV)发病率高，传染性强，给畜牧业带来了巨大的经济损失。LSDV与山羊痘病毒(GTPV)和羊痘病毒(SPPV)同属牛痘病毒，同源性高达97％。很难把他们区分开来。LSDV损害皮毛，导致产奶量急剧下降。世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health)将其归类为须报告的动物流行性出血热，中国将其归类为2类动物疫病。然而，目前还没有有效的治疗方法，因此LSDV的识别和监测、对于海关口岸、养殖场、基层动物疫病防控机构的现场快速检查具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术开发了一种超快速无需核酸提取的方法检测LSDV。基于RoomTemp样品裂解试剂盒，超快速qPCR在15min和50s内完成核酸扩增，无需核酸提取。这大大减少了测试过程，比传统的qPCR少64分钟。超快速qPCR的检出限为2.5
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103copies
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μL
‑1。为了进一步提高灵敏度，本专利技术介导CRISPR/Cas12a检测超快速PCR产物。检出限低至2
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‑1。因此，无需核酸提取的超快速PCR与CRISPR/Cas12a结合，节省了时间和试剂成本，提高了灵敏度和特异性。在核酸检测中具有广阔的应用前景。目前国内外尚无超快速PCR和CRISPR/Cas12a的无核酸提取步骤的LSDV检测方法。因此，建立了超快速PCR和CRISPR/Cas12a的无核酸提取步骤的LSDV检测方法，这对于海关口岸、养殖场、基层动物疫病防控机构的现场快速检查具有重要意义。
[0006]为获得对LSDV更快速和灵敏的检测方法，本专利技术提供了超快速qPCR所用引物和探针，准确鉴定出LSDV。第一个目的是基于以上引物和探针构建超快速qPCR，并建立无核酸提取的直接扩增的分子并行检测方法。第二个目的是为提高灵敏度，用CRISPR/Cas12a结合超快速PCR提供更快速的、更特异的检测方法。第三个目的是为实现可视化检测，横向流动试纸条技术结合超快速PCR和CRISPR/Cas12a提供更加便携和可视化的方法。
[0007]为了实现上述第一目的，本专利技术采用的技术方案是：超快速无需核酸提取牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒，包括裂解体系中的裂解缓冲液和稳定缓冲液，超快速qPCR体系中的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示探针。
[0008]检测方法包括以下步骤：
[0009]裂解体系，样品裂解无需核酸提取：用RoomTemp Sample Lysis Kit裂解样品，样品中含有裂解缓冲液和稳定缓冲液。取2μL血液或细胞悬液加入20μL裂解缓冲液，室温孵育3min，然后加入20μL稳定缓冲液，得到靶标物，可直接用于后续检测。
[0010]超快速qPCR体系：由1μL 10
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Fast BufferⅠ、1μL 0.25U SpeedSTAR HS DNA聚合酶、1.5μL 2mM dNTP混合物、正向引物、反向引物和探针5μM各1μL、2μL ddH2O和1.5μL靶标物组成。扩增程序为：95℃扩增1min；40个循环：95℃3s和58℃4s。扩增过程需要15min 50s。
[0011]结果判定：在40个循环中出现荧光信号为阳性；无荧光信号为阴性。
[0012]为了实现上述第二个目的，本专利技术采用的技术方案是：超快速无需核酸提取牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒，包括裂解体系中的裂解缓冲液和稳定缓冲液，Fast BufferⅠ、SpeedSTAR HS DNA聚合酶、dNTP混合物，LbCas12a，Reaction缓冲液，超快速PCR体系中的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物，CRISPR/Cas12a体系中的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的crRNA、和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的ssDNA reporter。
[0013本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒，其特征在于：包括裂解体系中的裂解缓冲液和稳定缓冲液，超快速qPCR体系中的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示探针。2.根据权利要求1所述超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒，其特征在于：所述裂解体系将血液或细胞悬液加入裂解缓冲液，然后加入稳定缓冲液，得到靶标物；所述超快速qPCR体系包括：1μL 10
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Fast BufferⅠ、1μL 0.25U DNA聚合酶、1.5μL 2mM dNTP混合物、正向引物、反向引物和探针5μM各1μL、2μLddH2O和1.5μL靶标物，扩增程序为：95℃扩增1min；40个循环：95℃3s和58℃4s。3.根据权利要求2所述超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶选用SpeedSTAR HSDNA聚合酶。4.根据权利要求2或3所述超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒，其特征在于：结果判定为：在40个循环中出现荧光信号为阳性；无荧光信号为阴性。5.超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒，其特征在于：包括裂解体系中的裂解缓冲液和稳定缓冲液，超快速PCR体系中的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物，CRISPR/Cas12a体系中的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的crRNA、LbCas12a和ssDNA报告物。6.根据权利要求5所述超快速无需核酸提取的牛结节性皮肤病病毒检测试剂盒，其特征在于：所述裂解体系将血液或细胞悬液加入裂解缓冲液，然后加入稳定缓冲液，得到靶标物；所述超快速PCR体系包括：1μL 10
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Fast BufferⅠ、1μL 0.25U DNA聚合酶、1.5μL 2mM dNTP混...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂福平，曹改花，史梅梅，杨俊，侯长军，王国民，霍丹群，李应国，
申请(专利权)人：重庆海关技术中心，
类型：发明
国别省市：