本发明专利技术公开了荧光分子信标作为Cas12信号探针的新型冠状病毒检测试剂盒及检测方法，属于核酸检测领域。检测试剂盒包括：0.5μL 20μM crRNA(500nM)、0.5μL 10μM Cas12a蛋白(250nM)、1μL 10μM荧光分子信标(500nM)，后简称reporter、15μL缓冲液3.1和1μL RNA酶抑制剂。本发明专利技术首次利用分子信标探针解决了传统CRISPR/Cas信号读出方式中CRISPR荧光探针普遍存在灵敏度低、背景信号高的问题，拓宽了CRISPR/Cas探针设计方法，用于新冠病毒核酸检测中，具有良好的分析性能。在优化的实验条件下，使用单crRNA，对于ORF1a靶标的检测限为1pM,使用双crRNA检测限为100fM，灵敏度提高了10倍。在实际样品检测时，选取和新冠病毒序列相似性极高(85.8％)但传染性极低的GX/P2V，最低能够检测到27copies/mL。低能够检测到27copies/mL。
【技术实现步骤摘要】
荧光分子信标作为Cas12信号探针的新型冠状病毒检测试剂盒
[0001]本专利技术涉及一种新型冠状病毒检测试剂盒及检测方法，具体涉及荧光分子信标作为Cas12信号探针的新型冠状病毒检测试剂盒及检测方法，属于核酸检测领域。
技术介绍
[0002]核酸包括DNA和RNA，是遗传信息的载体，可作为多种疾病，如癌症以及病原体感染性疾病诊断的标志物。核酸分子诊断具有灵敏度高、实时性好、操作简便等优势，对癌症以及病原体感染性疾病的早期筛查及诊断具有重要意义。目前常用核酸检测方法主要包括基因测序法和核酸扩增检测法。
[0003]现有核酸检测方法大多操作步骤复杂且依赖于昂贵的仪器设备，被誉为“基因魔剪”的CRISPR/Cas系统在核酸检测方面展现出巨大潜力和优势。规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)是细菌中一种获得性免疫系统，与Cas蛋白组成CRISPR/Cas系统。其中Cas12a、Cas13a和Cas14a在特异性识别目标分子后，激活了“反式切割”活性，会继续非特异切割其他单链DNA(ssDNA)或RNA。但是目前基于CRISPR/Cas的核酸检测方法，主要利用试纸条或荧光荧光分子信标定性或定量，信号读出方式较为单一。
[0004]分子信标(Molecular beacons)是一种具有茎环结构的新型荧光核酸探针，在茎部的两端修饰了荧光基团和猝灭基团，其特殊发夹结构使之具有高度的杂交特异性，能检测单碱基突变，这一特性使其优于其他一些传统的核酸探针，分子信标保持完整的茎环结构时，其荧光基团的荧光信号被猝灭基团几乎完全吸收，当由于碱基互补配对等作用使茎环结构打开时，荧光信号由于远离猝灭基团，荧光恢复。分子信标具有背景信号低、灵敏度高、特异性强、操作简单等优点，是潜在的CRISPR/Cas检测的荧光探针。因此，自从分子信标在1996年被首次合成以后，已经在活体细胞和溶液中关于DNA/RNA/Protein的相互作用研究中发挥了重要的作用。
[0005]在CRISPR/Cas荧光荧光分子信标中，主要是目前普遍常用的是Donna课题组开发的ssDNA reporters，由5
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24个碱基构成的短链两端修饰荧光团和猝灭基团所构成，除此之外，Liu等人发现了激活后的Cas12a可以反式切割G四链体和G三链体探针。Mehmet V.Yigit等人发现激活后的Cas12a可以反式切割DNA双链结构，由此来设计分析检测方法。但是这些信号读出方式普遍存在灵敏度低、背景信号高等问题。
技术实现思路
[0006]有鉴于此，本专利技术提供了荧光分子信标作为Cas12信号探针的新型冠状病毒检测试剂盒及检测方法，利用分子信标探针解决了传统CRISPR/Cas信号读出方式中，荧光探针普遍存在灵敏度低、背景信号高的问题，拓宽了CRISPR/Cas探针设计方法，同时用于新冠病毒核酸检测中，具有良好的分析性能。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]荧光分子信标作为Cas12信号探针的新型冠状病毒检测试剂盒，包括：0.5μL 20μM crRNA(500nM)、0.5μL 10μM Cas12a蛋白(250nM)、1μL 100μM荧光分子信标(5μM)(后简称reporter)、15μL缓冲液3.1和1μL RNA酶抑制剂。
[0009]可选的，所述试剂盒包括：4μL 10μM Cas12a蛋白(2μM)、1μL 20μM crRNA(1μM)、11μL缓冲液3.1、1μL 10μM reporter(500nM)、1μL RNA酶抑制剂。
[0010]其中，Cas12a蛋白为Cpf1(Lba Cas12a)核酸内切酶，其是由单一指导RNA(gRNA)指导的可编程DNA核酸内切酶，靶向需要与靶位点互补的gRNA以及与靶序列相对的DNA链上的5
’
TTTV原间隔基序(PAM)，其切割发生在PAM的3
’
约17个碱基处，并留下5
’
突出端。
[0011]crRNA序列为：UAA UUU CUA CUA AG U G UAG AU UGUAC CGU CUG CGG UAU GUG的单序列；
[0012]或，
[0013]UAA UUU CUA CUA AG U G UAG AU UGUAC CGU CUG CGG UAU GUG和AAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGU UGUGAU CAA CUC CGCGA的双序列。
[0014]Reporter序列为：5
‑6‑
Texas Red
‑
TGG GAT ATC TTT AAT TTT ATT TTA ACA AGA TAT CCC A
‑
BHQ2
‑
3'。
[0015]RNA酶抑制剂为由大肠杆菌中纯化的猪肝RNA酶抑制剂得到的重组体。该酶的特征与猪肝和人胎盘来源的此类酶相似，与RNase A形成1：1复合体，抑制RNase活性，属蛋白质性质，与其它竞争性抑制剂(核酸类、无机磷酸类)不同，可以很容易地通过苯酚处理将其从反应体系中除去，但不能抑制反转录酶的RNase H的活性。
[0016]本专利技术还提供了上述荧光分子信标作为Cas12信号探针的新型冠状病毒的检测方法：将新型冠状病毒检测试剂盒中的crRNA、Cas12a蛋白、缓冲液3.1、RNA酶抑制剂以及2μL 100nM靶标加入至Eppendorf离心管中，再加入1μL 10μM reporter(500nM)，将所得混合物放入实时荧光PCR仪中，在47℃下反应1h，采集荧光信号。
[0017]本专利技术的有益效果在于：
[0018]1、本专利技术首次利用分子信标探针解决了传统CRISPR/Cas信号读出方式中CRISPR荧光探针普遍存在灵敏度低、背景信号高的问题，拓宽了CRISPR/Cas探针设计方法。
[0019]2、本专利技术的试剂盒用于新冠病毒核酸检测中，具有良好的分析性能，以新冠病毒核酸ORF1a为例，最低能够检测到1pM，证明Cas12a对分子信标探针具有良好的反式切割活性，可作为一种优良的荧光探针用于CRISPR/Cas类的探针设计中。
[0020]3、有研究报道双crRNA能够提高Cas12a反式切割反应的灵敏度，为此本专利技术提供了双crRNA，能够提高灵敏度，检测限为100fM，灵敏度提高了10倍。
[0021]4、由于流感病毒与新冠病毒具有相似的症状，尤其在秋冬季节等流感高发期，对于新冠病毒的筛选十分重要，本专利技术的试剂盒及检测方法对于新冠病毒检测具有良好的特异性。
附图说明
[0022]图1为本专利技术实施例3浓度优化实验结果图；
[0023]图2为本专利技术实施例4反应温度优化实验结果图；
[0024]图3为本专利技术实施例5本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.荧光分子信标作为Cas12信号探针的新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：0.5μL 20μM crRNA(500nM)、0.5μL 10μM Cas12a蛋白(250nM)、1μL 10μM荧光分子信标(500nM)，15μL缓冲液3.1和1μL RNA酶抑制剂。2.根据权利要求1所述的荧光分子信标作为Cas12a信号探针的新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：4μL 10μM Cas12a蛋白(2μM)、1μL 20μM crRNA(1μM)、11μL缓冲液3.1、1μL 10μM reporter(500nM)、1μL RNA酶抑制剂。3.根据权利要求1或2所述的荧光分子信标作为Cas12a信号探针的新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，所述Cas12a蛋白为Cpf1核酸内切酶。4.根据权利要求1或2所述的荧光分子信标作为Cas12a信号探针的新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，所述crRNA序列为：UAA UUU CUA CUA AG U G UAG AU UGUAC CGU CUG CGG UAU GUG的单crRNA序列；或，UAA UUU CUA CUA AG U G UAG AU U...
【专利技术属性】
技术研发人员：裴晓静，刘思彤，李姝静，何一凡，孟宏，董银卯，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：
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