牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒多重荧光RT-PCR检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术提供了牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒多重荧光RT

【技术实现步骤摘要】
牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒多重荧光RT
‑
PCR检测试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒多重荧光RT
‑
PCR检测试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]近年来，随着饲养规模化和集约化程度不断提高，各种疫病成为养牛产业生产中的重大困扰问题，严重制约着牛肉和牛奶的出产量。其中由多病原引起的腹泻类疫病是在养殖过程中最为常见的一类疾病。最常见的病原有BRV、BVDV、BEV等。这些病毒常引起犊牛腹泻，呼吸道等症状引起牛生产性能的大幅下降以及较高的死亡率，对养殖业的健康发展产生严重影响。同时，又伴随着病毒的不断变化，常规检测方法已经不能灵敏的检测到变异后的病毒，而且这些病原在临床症状上的表现极为相似，难以通过牛的临床特征诊断疾病。
[0003]牛轮状病毒病是由牛轮状病毒(Bovine rotavirus，BRV)引起的腹泻类疫病，是呼肠孤病毒科，轮状病毒属成员之一，双股RNA病毒，核苷酸长度约为18.5kb。轮状病毒包含7个不同的群(A
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G)，国内流行的主要牛轮状病毒为G6和G10型。该病毒主要引起犊牛的病毒性腹泻，临床特征为食欲不振、排黄绿色水样稀便，严重腹泻者粘膜脱落、粪便中混有血液或粘液。
[0004]牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea，BVD)是由牛病毒性腹泻病毒引起的一种常见的牛传染性疾病，BVDV是具有囊膜的单股正链RNA病毒，长度约12.5kbp。为黄病毒科瘟病毒属成员，其基因组5'
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UTR核苷酸序列的差异，将其分为BVDV
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1、BVDV
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2和BVDV
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3三种基因型。国外以BVDV
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2a毒株为主，国内主要存在BVDV
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1b、BVDV
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1a和BVDV
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1c三种基因型毒株。这种病毒的感染会引起呼吸系统和生殖的影响以及免疫抑制，在一些情况下可能呈现经典或出血性腹泻，该病毒还可通过胎盘传播，引发胚胎死亡、流产。自1946年首次报道该病后，由于缺少防控技术，在全球大范围流行。BVDV具有极高的死亡率和发病率，而且BVD如果通过胎盘屏障，容易导致牛产生(PI)，PI是终身携带者，是病毒传播的主要途径。
[0005]肠道病毒(enterovirus，EV)小核糖核酸病毒科肠道病毒属成员，该病毒为无囊膜单股正链RNA病毒，病毒粒子大小为20～30nm,具有典型的二十面体结构，根据国际病毒分类委员会(ICTV)的最新分类，肠道病毒属分为12个肠道病毒种(A
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L)与3个鼻病毒种(A
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C)，其中E种(EV
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E)和F种(EV
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F)主要感染牛，G种主要感染猪，H、J种主要感染灵长类动物，I种主要感染单峰骆驼，K、L为新的肠道病毒种。受感染的牛表现出典型的呼吸道和胃肠道症状，给养殖业造成严重损失，且疾病的暴发和流行有逐渐增加的趋势。二十世纪五十年代Moll和Davis首次从患病牛的粪便中分离出牛肠道病毒。实验室常用的疫病检测方法有病毒分离，RT
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PCR，双抗体夹心ELISA，血清中和试验，血凝抑制实验等，这些方法虽然在鉴别诊断BRV、BVDV、BEV方面作出了巨大的贡献，但仍无法准确识别出混合病毒感染情况及病毒载毒量等问题，难以表明真实牛群感染真实情况。目前用于检测BRV、BVDV、BEV的方法主要有病毒分离，和ELSIA等，但是病毒分离和ELSIA检测耗时、检测灵敏度低、易出现假阴性，且
Red和MGB；牛肠道病毒的上、下游引物BEV
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P1、BEV
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P2的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，探针BEV
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Probe的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，其5
′
端和3
′
端分别对应标记CY5和BHQ3；
[0021](3)收集荧光信号，选择上述荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；
[0022](4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。
[0023]如上所述的多重荧光定量RT
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PCR方法，其特征在于，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应体系具体如下：25μL反应体系中，BRV
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P1、BRV
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P2、BRV
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Probe、BVDV
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P1、BVDV
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P2、BVDV
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Probe、BEV
‑
P1、BEV
‑
P2、BEV
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Probe的浓度对应为：0.4μmol/L，0.4μmol/L，0.4μmol/L；0.6μmol/L，0.6μmol/L，0.6μmol/L；0.4μmol/L，0.4μmol/L，0.4μmol/L；2
×
Premix Ex Taq(Probe qPCR)酶缓冲液，12.5μL，模板各1μL，去离子水补足至总体积25μL；反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，40个循环。
[0024]如上所述的多重荧光定量RT
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PCR方法，优选地，牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒的检测Ct值分别对应为Ct值≤34.0、Ct值≤33.0、Ct值≤36.0，且有典型对数扩增曲线，判定为阳性；否则判定为核酸检测阴性。具体的所述三重RT
‑
PCR检测的结果判定方法为：反应结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果，结果判断依据如表1所示：
[0025]表1三重RT
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PCR检测的结果判定依据
[0026][0027][0028]本专利技术的有益效果在于：
[0029]本专利技术提供的一种本专利技术提供了同时检测牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒的多重荧光RT
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PCR的核酸组，该组核酸用于同步检测这三种病毒时，其检测灵敏度高，特异性强，重复性好，经过验证，相互之间不发生交叉反应。
[0030]本专利技术提供的同时检测牛轮状病毒，牛肠道病毒，牛流行性腹泻三重实时荧光RT
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PCR检测方法，提供的检测BRV、BVDV、BEV三对引物和探针，该方法仅对BRV、BVDV、BEV核酸检测为阳性，即只能扩增出目的基因曲线，对牛细小病毒(BPV)、牛冠状病毒(BCOV)、牛诺如病毒(BNoV)、牛嵴病毒(BKoV)、牛星状病毒(BoAstV)等病毒核酸检测结果均为阴性，表明该方法具有较高的特异性。敏感性结本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于同时检测牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒的引物和探针，其特征在于，其包括检测牛轮状病毒的上下游引物BRV
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P1、BRV
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P2、探针BRV
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Probe，检测牛病毒性腹泻病毒的上下游引物BVDV
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P1、BVDV
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P2、探针BVDV
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Probe和检测牛肠道病毒的上下游引物BEV
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P1、BEV
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P2及探针BEV
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Probe；其中，检测牛轮状病毒的上游引物BRV
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P1的序列如SEQ ID No.1所示，下游引物BRV
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P2的序列如SEQ ID No.2所示，探针BRV
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Probe的序列如SEQ ID No.3所示；检测牛病毒性腹泻病毒的上游引物BVDV
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P1的序列如SEQ ID No.4所示，下游引物BVDV
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P2引物的序列如SEQ ID No.5所示；探针BVDV
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Probe的序列如SEQ ID No.6所示；检测牛肠道病毒的上游引物BEV
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P1的序列如SEQ ID No.7所示，下游引物BEV
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P2的序列如SEQ ID No.8所示；探针BEV
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Probe的序列如SEQ ID No.9所示。2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，探针的5
′
端标记有的荧光报告基团，所述探针的3
′
标记有的淬灭基团。3.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，荧光报告基团为FAM、Texas Red、Cy5、CF647、Alexa647、CF488、HEX、VIC、CF532、Cy5.5、CF680、或Quasar705中的任一种，淬灭基团为BHQ1、MGB、BHQ3、BHQ2、TAMRA或MAX中与荧光报告基团相对应一种。4.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针BRV
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Probe、BVDV
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Probe和BEV
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Probe的5
′
端和3
′
端分别对应标记FAM
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BHQ1、Texas Red
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MGB和CY5
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BHQ3。5.用于同时检测牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒的试剂盒，其包括如权利要求1
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4中任一项所述的引物和探针。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，其还包括2
×
Premix Ex Taq(Probe qPCR)酶缓冲液，和阳性对照品。7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，阳性对照品为BRV阳性对照含SEQ ID NO.10所示核苷酸序列，BVDV阳性对照含SEQ ID NO.11所示核苷酸序列，BEV阳性对照含SEQ ID NO.12所示核苷酸序列。8.一种用于同时检测牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒的多重荧光定量RT
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【专利技术属性】
技术研发人员：闫若潜，班付国，刘影，王东方，康台生，王淑娟，马震原，陈瑞，谢彩华，杨晴，柴茂，赵雪丽，杨海波，董剑辉，郭育培，张磊，冯平，胡煜锋，
申请(专利权)人：陕西诺威利华生物科技有限公司驻马店市动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：