三重检测BCoV、BVDV、IBRV的引物对、探针、检测试纸及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种三重检测BCOV、BVDV、IBRV的引物对、探针、检测试纸，针对BCoV、BVDV、IBRV筛选获得特定引物对、探针并不断优化检测试纸组份，开发三重检测试纸及其应用方法，实现对三种病毒的混合感染的快速、准确检测，获得稳定性、特异性、灵敏度良好，快速、准确，操作简单、反应条件不受限制便于基层使用的临床检测试纸，能够做到对混合感染病例的早期鉴别诊断，对于犊牛腹泻病、牛传染性鼻气管炎病等多种致死率极高的疾病的临床诊断、监测和流行病学调查有很重要的意义，在养牛业的发展中具有高度产业利用价值。高度产业利用价值。高度产业利用价值。

【技术实现步骤摘要】
三重检测BCoV、BVDV、IBRV的引物对、探针、检测试纸及其应用


[0001]本专利技术涉及动物疫病检测
，具体涉及两种检测方法分别为三重BCoV、BVDV、IBRV病毒的引物对、探针、检测试纸及其应用。

技术介绍

[0002]牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)是导犊牛腹泻的主要病毒。犊牛腹泻病作为一种在肉牛和奶牛养殖过程中最为常见的疾病，因该病在犊牛群中有极高的发病率和死亡率，病因复杂，被世界公认为是肉牛和奶牛养殖的难题之一，甚至称该病为“犊牛杀手”。
[0003]牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)会引起牛传染性鼻气管炎病毒，又称“坏死性鼻炎”、“红鼻病”，是一种牛呼吸道接触性传染病。临床表现形式多样，以呼吸道为主，伴有结膜炎、流产、乳腺炎，有时诱发小牛脑炎等。IBRV感染后经常继发多种细菌感染，尤其是新生犊牛，可以继发大肠杆菌、巴氏杆菌、链球菌等多种细菌的感染，犊牛发病率和死亡率极高，一旦感染对于规模化牛场造成的经济损失巨大，严重威胁着养牛业的健康发展。
[0004]病毒的检测方法主要有电镜技术、血清学检测法如酶联免疫吸附反应(Enzyme linked immunosorbentassay,ELISA)和分子生物学检测法包括聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术和实时荧光PCR等。病毒的分离鉴定虽然是诊断病毒的有效手段，其特异性强，但非常费时费力，需要专业的技术人员，不适合推广使用。血清学检测方法比较费时、费力。免疫荧光、ELLSA等方法虽然具有微量、特异、快速、准确的优点，但需要比较完备的试验仪器和经验丰富的技术人员来操作和判断结果，检测一批样品整个流程需要4～8小时，对于基层工作场所很难做到。PCR及核酸探针的诊断更需要有特殊的仪器和药品，技术含量很高，一般只适于实验室诊断或研究应用，很难在基层推广。因此，迫切需要建立一种简单、快速、灵敏、廉价并且适合于基层应用的病毒诊断方法。为了适用现场检测的要求，恒温扩增方法得到了广泛的应用。
[0005]因此，如何针对牛冠状病毒(BCoV)、牛病毒性腹泻病(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)三种对于养牛过程中危害巨大的病毒，开发一种能够检测混合感染，并且稳定性、特异性、灵敏度良好，快速、准确，操作简单、反应条件不受限制便于基层使用的临床检测方法及相关产品，对于犊牛腹泻病、牛传染性鼻气管炎病等多种致死率极高的疾病的临床诊断、监测和流行病学调查有很重要的意义。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中对于BCoV、BVDV及IBRV的检测多采用病原分离等，检测敏感性较低，特异性差，成本较高，不能满足对疾病早期诊断、早期预防的需求，更难以做到技术问题。本专利技术旨在提供三重检测BCoV、BVDV、IBRV的引物对、探针、检测试纸及其应用的技术方案，通过筛选获得特定引物对、探针并不断优化检测试纸组份，开发三重检测试纸及其应
用，实现对BCoV、BVDV、IBRV混合感染的快速、准确检测，获得稳定性、特异性、灵敏度良好，快速、准确，操作简单、反应条件不受限制便于基层使用的临床检测试纸，能够做到对混合感染病例的早期鉴别诊断，对于犊牛腹泻病、牛传染性鼻气管炎病等多种致死率极高的疾病的临床诊断、监测和流行病学调查有很重要的意义，在养牛业的发展中具高度产业利用价值。
[0007]本专利技术通过以下技术方案实现的：
[0008]本专利技术提供用于三重检测BCoV、BVDV、IBRV的RAA
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LFD引物组，所述引物组包括3对引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。
[0009]所述的于三重检测BCoV、BVDV、IBRV的RAA
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LFD引物组，其特征在于，所述BCoV选择SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2引物作为最终筛选的引物对；BVDV选择SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4引物作为最终筛选的引物对；IBRV选择SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6引物作为最终筛选的引物对。
[0010]进一步的，本专利技术提供用于三重检测BCoV、BVDV、IBRV的RAA
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LFD探针组，其特征在于，所述探针组包括3条探针序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示。
[0011]所述的于三重检测BCoV、BVDV、IBRV的RAA
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LFD探针组，其特征在于，所述BCoV选择SEQ ID NO.7作为探针；BVDV选择SEQ ID NO.8作为探针；IBRV选择SEQ ID NO.9作为探针。
[0012]更进一步的，本专利技术提供用于三重检测BCoV、BVDV、IBRV的RAA
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LFD检测试纸，其特征在于，所述试纸包括如下组分：
[0013]C buffer：20μL、Lbuffer：5μL、dNTPs(10mM):1.5μL、P
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core：12μL、N
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core：0.6μL、B buffer：2.5μL；
[0014]上游引物SEQ ID NO.1(10uM)：0.67μL、下游引物SEQ ID NO.10(10uM)：0.67μL、探针SEQ ID NO.11(10uM)：0.2μL、模板A：1.26μL；
[0015]上游引物SEQ ID NO.3(10uM)：0.67μL、下游引物SEQ ID NO.12(10uM)：0.67μL、探针SEQ ID NO.13(10uM)：0.2μL、模板A：1.26μL；
[0016]上游引物SEQ ID NO.5(10uM)：0.67μL、下游引物SEQ ID NO.14(10uM)：0.67μL、探针SEQ ID NO.15(10uM)：0.2μL、模板A：1.26μL。
[0017]本专利技术提供用于三重检测BCoV、BVDV、IBRV的RAA
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LFD检测试纸，所述检测试纸条包括：样品结合垫、检测线(T线)、质控线(C线)。
[0018]优选的，所述样品结合垫含有胶体金标记鼠抗FAM的单克隆抗体和羊抗鼠IGg抗体；所述质控线C线为羊抗鼠IGg抗体。
[0019]进一步的，所述检测线包括：检测线T1、检测线T2、检测线T3。
[0020]优选的，所述检测线T1包被为链霉亲和素用于检测BCoV。
[0021]优选的，所述检测线T2包被为罗丹明单克隆抗体用于检测IBRV。
[0022]优选的，所述检测线T3包被为地高辛单克隆抗体用于检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于三重检测BCoV、BVDV、IBRV的RAA
‑
LFD引物组，所述引物组包括3对引物，其特征在于，所述引物组核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；所述BCoV选择SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2引物作为最终筛选的引物对；BVDV选择SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4引物作为最终筛选的引物对；IBRV选择SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6引物作为最终筛选的引物对。2.用于三重检测BCoV、BVDV、IBRV的RAA
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LFD探针组，所述探针组包括3条探针序列，其特征在于，所述探针组核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示；所述BCoV选择SEQ ID NO.7作为探针；BVDV选择SEQ ID NO.8作为探针；IBRV选择SEQ ID NO.9作为探针。3.用于三重检测BCoV、BVDV、IBRV的RAA
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LFD检测试纸，其特征在于，所述试纸包括如下组分：C buffer：20μL、Lbuffer：5μL、dNTPs(10mM):1.5μL、P
‑
core：12μL、E
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core：0.6μL、B buffer：2.5μL；上游引物SEQ ID NO.1(10uM)：0.67μL、下游引物SEQ IDNO.10(10uM)：0.67μL、探针SEQ ID NO.11(10uM)：0.2μL、模板A：1.26μL；上游引物SEQ ID NO.3(10uM...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚刚，董可儿，陈利苹，丁龙，马雪连，钟旗，赵宗岐，孙亚伟，李娜，吾买尔江，
申请(专利权)人：新疆农业大学，
类型：发明
国别省市：