海水中诺如病毒活病毒检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及海洋水环境监测技术领域，尤其涉及一种海水中诺如病毒活病毒检测试剂盒及检测方法。海水中诺如病毒活病毒的检测试剂盒包括如序列表SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
海水中诺如病毒活病毒检测试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及海洋水环境监测
，尤其涉及一种海水中诺如病毒活病毒检测试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]诺如病毒，又称诺瓦克病毒是人类杯状病毒科（Human Calicivirus, HuCV）中诺如病毒（Norovirus, NV）属的一种无包膜单股正链RNA病毒，同时也是全球急性胃肠炎（AGE）的最重要病因之一，流行地区极为广泛，全年均有流行，感染对象主要为成人和学龄儿童，常分布在医院、餐馆、学校、养老院、家庭等。该病毒主要传播途径为主要通过粪
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口途径传播，人感染了诺如病毒通常是由于饮用受污染的水、食品及生活接触，其中饮用受污染的水是重要途径之一。对水中NoV的准确检测能为诺如病毒胃肠炎防控提供科学依据。有效的检测方法是保证检测时效性的根本。
[0003]水体中诺如病毒检测的难点在于含量太低、干扰测定的基本成份复杂，给准确测定造成了很大的困难。大部分水体需先通过水样中病毒的浓缩，才能进行检测，但水中不必要的污染物也因此被浓缩吸附，从而干扰试验结果。如通常使用絮凝沉淀法对水样进行浓缩，但其残留的有机物质可能会对PCR结果造成影响。另外传统的病毒浓缩方法，如细胞培养病毒鉴定，在操作上比较耗时，在技术成本的花费上比较昂贵，而且病毒很难在体外环境下进行培养。
[0004]此外，目前诺如病毒还未有可靠的体外培养技术，因此，主要通过逆转录实时定量聚合酶链式反应（RT
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qPCR）进行检测。而上述方法存在如下问题：1、尚没有针对海水中诺如病毒富集后的活病毒检测的方法；2、qPCR方法仅能检测病毒核酸量，但无法鉴别病毒活性；3、电镜观察技术虽然可以对活病毒鉴别，但是操作复杂，成本较高。
[0005]活病毒是判断病毒是否对人体造成危害的前提。PMA是一种核酸嵌入剂，对活细胞具有很好的选择性，该染料不易通过完整细胞膜，从而避免了对DNA的损伤，提高了对活细胞鉴别准确性，近年来，PMA逐渐被升级版叠氮溴化丙锭（PMAxx）代替，该染料更能区分活细胞与死细胞，消除了非活性病原体对检测结果的影响。染料联合分子生物学技术（PCR和qPCR）有望成为环境监/检测中的有效工具，但是目前的研究大多集中在临床和食品安全中，且主要应用于细菌学指标的检测。
[0006]纳米氧化铝陶瓷滤膜水体病毒富集法是目前水体中病毒富集效率最高的方法之一，在海水、自来水、地表水、地下水等水体环境病毒检测中普遍使用。

技术实现思路

[0007]本专利技术为解决上述问题，提供一种海水中诺如病毒活病毒检测试剂盒及检测方法。
[0008]本专利技术第一目的在于提供一种海水中诺如病毒活病毒的检测试剂盒，包括检测海水中诺如病毒活病毒的qRT
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PCR引物及探针：
GⅠ型诺如病毒引物及探针：GI
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GI
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；或/和GⅡ型诺如病毒引物及探针：G
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。
[0009]优选的，试剂盒的反应体系包括：Premix Ex Taq（2
×
）10μLProbe0.8μLPCR Forward Primer（10 μM）0.4μLPCR Reverse Primer（10 μM）0.4μL核酸模板2μL灭菌水6.4μL总体积20μL。
[0010]优选的，试剂盒的反应条件为：94℃，3min预热；94℃、30s，60℃、30s，72℃、1min，共40个循环。
[0011]本专利技术第二目的在于提供一种海水中诺如病毒活病毒的检测方法，具体包括如下步骤：S1、样品预处理：从海水中取待测样品，浓缩富集，洗脱，得到病毒浓缩样品；S2、核酸染料筛选：将核酸染料与病毒浓缩样品混匀，转移至黑暗环境中避光孵育；孵育后，在特定光源下照射，照射过程中维持温度在15~25℃；S3、核酸提取和逆转录：用试剂盒对筛选处理后的病毒浓缩样品进行核酸提取和逆转录；S4、诺如病毒检测体系的建立：设计引物及探针序列，具体包括：GⅠ型诺如病毒引物及探针：GI
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；GⅡ型诺如病毒引物及探针：G
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；将逆转录产物加入检测体系，进行实时定量聚合酶链式反应扩增反应；S5、检测荧光值：进行实时荧光检测，选择FAM通道，定期收集荧光值；S6、结果判断：检测到发荧光表示样品含有诺如病毒活病毒，同时得到样品中活病毒的拷贝数。
[0012]优选的，步骤S4中的检测体系为：
Premix Ex Taq（2
×
）10μLProbe0.8μLPCR Forward Primer（10 μM）0.4μLPCR Reverse Primer（10 μM）0.4μL核酸模板2μL灭菌水6.4μL总体积20μL；所述检测体系中设置阳性梯度对照，所述阳性梯度对照具体操作步骤包括：使用微量紫外分光光度计测定核酸浓度，将阳性样本进行10倍梯度稀释，将稀释102‑
108的样本顺序组成梯度，分别加入检测体系；所述实时定量聚合酶链式反应扩增反应的条件为：94℃，3min预热；94℃、30s，60℃、30s，72℃、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.海水中诺如病毒活病毒的检测试剂盒，其特征在于：包括检测海水中诺如病毒活病毒的qRT
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PCR引物及探针：GⅠ型诺如病毒引物及探针：GI
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；或/和GⅡ型诺如病毒引物及探针：G
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。2.根据权利要求1所述的海水中诺如病毒活病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的反应体系包括：Premix Ex Taq（2
×
） 10μLProbe0.8μLPCR Forward Primer（10 μM）0.4μLPCR Reverse Primer（10 μM）0.4μL核酸模板2μL灭菌水6.4μL总体积20μL。3.根据权利要求2所述的海水中诺如病毒活病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的反应条件为：94℃，3min预热；94℃、30s，60℃、30s，72℃、1min，共40个循环。4.海水中诺如病毒活病毒的检测方法，其特征在于：具体包括如下步骤：S1、样品预处理：从海水中取待测样品，浓缩富集，洗脱，得到病毒浓缩样品；S2、核酸染料筛选：将核酸染料与病毒浓缩样品混匀，转移至黑暗环境中避光孵育；孵育后，在特定光源下照射，照射过程中维持温度在15~25℃；S3、核酸提取和逆转录：用试剂盒对筛选处理后的病毒浓缩样品进行核酸提取和逆转录；S4、诺如病毒检测体系的建立：设计引物及探针序列，具体包括：GⅠ型诺如病毒引物及探针：GI
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；GⅡ型诺如病毒引物及探针：G
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；将逆转录产物加入检测体系，...

【专利技术属性】
技术研发人员：明红霞，樊景凤，李东蔚，苏洁，石婷婷，林建楠，
申请(专利权)人：国家海洋环境监测中心，
类型：发明
国别省市：