一种催化活性提高的几丁质脱乙酰酶AsCDA突变体及其应用制造技术

本发明专利技术在野生型申氏不动杆菌Acinetobacterschindleri几丁质脱乙酰酶AsCDA的基础上(如SEQ ID NO.12)，将Leu

【技术实现步骤摘要】
一种催化活性提高的几丁质脱乙酰酶AsCDA突变体及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体公开了细菌Acinetobacterschindleri几丁质脱乙酰酶的突变体。

技术介绍

[0002]壳聚糖是自然界中唯一的阳离子碱性GRAS(公认安全)级生物资源，有抑菌、抗癌、降低胆固醇和降血压等生物活性，被广泛应用于食品工业、医药、农业和化妆品等领域。因此，导致壳聚糖及其衍生物相关产品的需求量逐年增加，供不应求。中国作为全球最大的壳聚糖生产国和出口国，每年有超过100万吨虾蟹壳来源的几丁质废弃物可用于生产壳聚糖。目前，工业上使用热碱法规模化制备壳聚糖，壳聚糖产品存在质量差、价格低廉的问题，且生产过程中产生大量难以处理的废水给土壤、河流、空气等造成严重污染。在可再生资源高值利用战略目标和传统高污染产业转型升级的大背景下，急需寻求壳聚糖绿色制备的新途径，以促进壳聚糖产业的转型升级和几丁质的高值利用。
[0003]几丁质脱乙酰酶(CDA)可以催化几丁质脱去乙酰基绿色制备壳聚糖，一旦被规模放大可替代工业上现行的热碱法，实现壳聚糖行业的绿色转型升级和几丁质生物资源高值利用，其经济和生态意义重大。1975年首次在Mucor rouxii发现CDA至今，研究者相继对真菌、细菌和昆虫等来源CDAs的克隆表达、酶学性质、结构与功能关系等方面进行了深入研究，结果表明CDAs对小分子的几丁寡糖脱乙酰活性高，但其对大分子的晶体几丁质催化效率低，这极大限制了CDAs酶工业化应用和壳聚糖产业转型升级。

技术实现思路
<br/>[0004]针对现有技术的不足，本专利技术基于AsCDA与几丁寡糖的分子对接和分子动力学模拟的结果，选取位于酶
‑
底口袋的Leu
69
、Gly
180
、Arg
181
和Met
235
四个位点设计半理性设计改造策略，对Leu
69
、Gly
180
、Arg
181
和Met
235
四个位点进行迭代饱和突变，最终获得四突变体M11，其比酶活提高了1.73倍，催化效率也显著提高；并进一步对其催化晶体几丁质制备壳聚糖的酶学特性进行了评估。
[0005]一种几丁质脱乙酰酶AsCDA突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
[0006]本专利技术提供了所述几丁质脱乙酰酶AsCDA突变体的筛选方法，包括以下步骤：
[0007]1)重组载体pNCMO2
‑
His
‑
tag
‑
AsCDA的构建；
[0008]以申氏不动杆菌MCDA01的基因组(Acinetobacter schindleri MCDA01，菌株保藏号为CGMCC NO.13539)为模板，进行扩增PCR扩增，然后克隆到AsCDA的完整CDs；
[0009]使用限制性内切酶BamHI和HindIII分别酶切AsCDA的CDs和pNCMO2表达载体，然后用DNA连接酶将二者连接；
[0010]进行短小芽孢杆菌B.choshinensis转化，筛选阳性转化子扩增后提取质粒，得到重组载体pNCMO2
‑
His
‑
tag
‑
AsCDA。
[0011]2)突变文库的构建；
[0012]以pNCMO2
‑
His
‑
tag
‑
AsCDA为模板，利用定点饱和突变引物对，对AsCDA酶
‑
底口袋区域的Leu
69
、Gly
180
、Arg
181
和Met
235
四个位点进行迭代饱和突变，利用Dpn I酶消化原始模板，得到pNCMO2
‑
His
‑
tag
‑
AsCDA
mut
，然后将其转入感受态E.coli JM109中，挑取阳性转化子进行测序，从而构建突变菌株文库。
[0013]3)高通量筛选方法；将测序正确的各重组质粒pNCMO2
‑
His
‑
tag
‑
AsCDA
mut
分别转到短小芽孢杆菌进行分泌表达，突变体的筛选在96孔深孔板中进行，发酵结束后离心，上清液即为粗酶液，采用对硝基苯胺显色法测定发酵上清液中几丁质脱乙酰酶的酶活力，筛选出活力高的突变体。
[0014]优选地，所述步骤1)中PCR的扩增反应体系如下：
[0015][0016]优选的，所述AsCDA
‑
F序列为SEQ ID NO.2，AsCDA
‑
R序列为SEQ ID NO.3。
[0017]优选地，所述步骤1)中酶切体系如下：
[0018][0019]37℃条件下BamHⅠ和HindⅢ双酶切2h。
[0020]优选地，所述步骤1)中连接体系如下：
[0021][0022][0023]22℃水浴连接4h。
[0024]优选地，所述步骤1)中短小芽孢杆菌的转化方法为：(1)将10μL待转化的质粒至于4℃条件下保温10min；(2)将混匀的质粒全部加入短小芽孢杆菌感受态细胞中，震荡5s后静置5min；(3)在体系中继续加入150μL 40％PEG6000，震荡混匀5
‑
10s；(4)将上述液体与3000rpm、4℃条件下离心5min，去除上清；(5)加入1m L MT培养基后于200rpm、37℃条件下
培养2h；(6)3000rpm、4℃条件下离心，收集菌体，将菌体涂布至MT培养基中，过夜培养。MT培养基为在TM培养基的基础上添加4g
·
L
‑1的MgCl2。
[0025]优选地，所述步骤2)中AsCDA酶
‑
底口袋的Leu
69
位点饱和突变正反向引物对序列分别为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。
[0026]优选地，所述步骤2)中AsCDA酶
‑
底口袋的Gly
180
位点饱和突变正反向引物对序列分别为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。
[0027]优选地，所述步骤2)中AsCDA酶
‑
底口袋的Arg
181
位点饱和突变正反向引物对序列分别为SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9。
[0028]优选地，所述步骤2)中AsCDA酶
‑
底口袋的Met
235
位点饱和突变正反向引物对序列分别为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11。
[0029]本专利技术还提供了所述几丁质脱乙酰酶AsCDA突变体的表达纯化方法，包括以下步骤：
[0030]S1重组菌株的诱导表达：将本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种几丁质脱乙酰酶AsCDA突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。2.权利要求1所述几丁质脱乙酰酶AsCDA突变体的筛选方法，包括以下步骤：1)重组载体pNCMO2
‑
His
‑
tag
‑
AsCDA的构建；以申氏不动杆菌MCDA01的基因组(AcinetobacterschindleriMCDA01，菌株保藏号为CGMCCNO.13539)为模板，进行扩增PCR扩增，然后克隆到AsCDA的完整CDs；使用限制性内切酶BamHI和HindIII分别酶切AsCDA的DAs和pNCMO2表达载体，然后用DNA连接酶将二者连接；进行短小芽孢杆菌B.choshinensis转化，筛选阳性转化子扩增后提取质粒，得到重组载体pNCMO2
‑
His
‑
tag
‑
AsCDA；2)突变文库的构建；以pNCMO2
‑
His
‑
tag
‑
AsCDA为模板，利用定点饱和突变引物对，对AsCDA酶
‑
底口袋区域的Leu
69
、Gly
180
、Arg
181
和Met
235
四个位点进行迭代饱和突变，利用DpnI酶消化原始模板，得到pNCMO2
‑
His
‑
tag
‑
AsCDA
mut
，然后将其转入感受态E.coliJM109中，挑取阳性转化子进行测序，从而构建突变菌株文库；3)高通量筛选方法；将测序正确的各重组质粒pNCMO2
‑
His
‑
tag
‑
AsCDA
mut
分别转到短小芽孢杆菌进行分泌表达，突变体的筛选在96孔深孔板中进行，发酵结束后离心，上清液即为粗酶液，采用对硝基苯胺显色法测定发酵上清液中几丁质脱乙酰酶的酶活力，筛选出活力高的突变体。3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)中PCR的扩增反应体系如下：优选地，所述步骤1)中酶切体系如下：所述步骤1)中酶切体系如下：37℃条件下BamHⅠ和HindⅢ双酶切2h；优选地，所述步骤1)中连接体系如下：
22℃水浴连接4h。4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)中所述AsCDA
‑
F序列为SEQ ID NO.2，AsCDA
‑
R序列为SEQ ID NO.3。5.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)中短小芽孢杆菌的转化方法为：(1)将10μL待转化的质粒至于4℃条件下保温10min；(2)将混匀的质粒全部加入短小芽孢杆菌感受态细胞中，震荡5s后静置5min；(3)在体系中继续加入150μL40％PEG6000，震荡混匀5
‑
10s；(4)将上述液体与3000r...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨光，磨鸿娟，王毓涵，胡志红，苏彦文，东倬含，耿晓萌，房耀维，
申请(专利权)人：江苏海洋大学，
类型：发明
国别省市：