一种修饰型PD-1抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开修饰型PD

【技术实现步骤摘要】
一种修饰型PD
‑
1抗体及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种修饰型PD
‑
1抗体及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]过继T细胞疗法(Adoptive Cell Therapy，ACT)将自体或异体T细胞经过体外基因改造、激活和扩增后，输入至患者体内，依靠肿瘤特异性T细胞杀伤肿瘤。但目前ACT对实体瘤的疗效还不佳，主要原因包括在肿瘤微环境中，肿瘤细胞利用多种机制如分泌可溶性抑制因子或劫持免疫检查点信号通路来抑制T细胞的功能。肿瘤细胞高表达PD
‑
L1，能与T细胞表面的免疫检查点程序性死亡受体
‑
1(programmed cell death protein
‑
1，PD
‑
1)结合，从而逃避免疫清除。使用能阻断PD
‑
1信号通路的免疫检查点抑制剂(ICI)如PD
‑
1单抗(aPD1)，可抵抗来自肿瘤细胞的免疫抑制，从而提高外源性过继T细胞和内源性肿瘤特异性CD8+T细胞的疗效。但系统性应用的aPD1作用在过继T细胞上的药量不足，对过继T细胞的实体瘤杀伤能力提高有限，且会引起多种免疫相关不良反应。
[0003]目前免疫细胞的体内靶向药物递送系统运用的靶分子可包括抗体、生物小分子、核酸适配体、点击化学相关化学分子等。生物小分子如单糖(葡萄糖、甘露糖和半乳糖)和多肽等，化学结构简单，易化学合成，免疫原性低。例如，单糖甘露糖(Man)能与树突状细胞和巨噬细胞表达的CD206结合，而CD206也是实体瘤中M2类巨噬细胞(即TAMs)相对于M1类巨噬细胞过表达的标志物之一。因此，甘露糖基化的纳米载体已被用于靶向TAMs。但化学小分子与靶标的相互作用往往不强。核酸适配体(aptamers)是单链寡核苷酸，可以识别受体上的特定结合域，是较低分子量的靶向系统(5
‑
15kDa)。与小分子配体相比，Aptamers对目标受体亲和力有所提高，具有较强的的药物靶向递送潜力，已有研究设计出靶向幼稚T细胞的双特异性环化适配体(cb
‑
aptamers)，能同时识别肿瘤细胞并原位激活T细胞，从而诱导肿瘤特异性杀伤。单克隆抗体(mAbs)与靶向具有高度的特异性。Matthias T.Stephan等人用抗CD3e f(ab
’
)2片段与可生物降解的聚(β
‑
氨基)酯基纳米颗粒相连，靶向CD3+淋巴细胞递送构建CAR
‑
T细胞的DNA，实现了体内CAR
‑
T细胞的构建。但是，目前仍缺乏区分过继T细胞与内生T细胞的特异性天然靶点，因此运用靶向天然靶点的药物递送载体在体内的递送效率和特异性还有待提升。
[0004]点击化学是通过以碳
‑
杂原子键(C
‑
X
‑
C)连接为基础的，快速、高效的化学合成新方法。生物正交反应利用点击化学的原理在生物体内发生不干扰自身生化反应的化学反应。目前，叠氮糖已成功通过糖代谢，在体外或体内将叠氮(N3)标记于肿瘤细胞、免疫细胞等表面的糖蛋白上，且没有明显的细胞毒性。

技术实现思路

[0005]针对上述存在的技术问题，本专利技术目的是提供一种修饰型PD
‑
1抗体及其制备方法与应用。本专利技术的技术方案是：
[0006]本专利技术的其中一个目的在于提供一种修饰型PD
‑
1抗体的制备方法，所述的制备方法为运用N
‑
羟基丁二酰亚胺功能化的链接剂DBCO
‑
PEG4
‑
NHS与aPD1中的氨基反应，形成修饰型PD
‑
1抗体DBCO
‑
aPD1。
[0007]本专利技术的另一个目的在于提供另一种修饰型PD
‑
1抗体的制备方法，所述的制备方法包括：
[0008]将N
‑
羟基丁二酰亚胺功能化的链接剂DBCO
‑
PEG4
‑
NHS修饰到细胞色素C上，得到DBCO
‑
CC；
[0009]运用NHS
‑
S
‑
S
‑
NHS链接剂交联DBCO
‑
CC和aPD1，制备得到修饰型PD
‑
1抗体DBCO
‑
CC@aPD1。
[0010]优选地，运用NHS
‑
S
‑
S
‑
NHS链接剂交联DBCO
‑
CC和aPD1，制备得到修饰型PD
‑
1抗体DBCO
‑
CC@aPD1的步骤包括：
[0011]在aPD1中加入NHS
‑
S
‑
S
‑
NHS，室温条件下在四维旋转仪上反应，将产物转移至超滤管中，离心除去多余未结合的NHS
‑
S
‑
S
‑
NHS，用紫外分光光度计测定aPD1浓度，得到产物aPD1
‑
NHS；
[0012]在aPD1
‑
NHS中加入DBCO
‑
CC，再按10％的体积比向反应体系加入pH调节液调节pH至8.0，室温条件下在四维旋转仪上反应，将产物转移至超滤管中，离心除去多余未结合的DBCO
‑
CC，收集制备得到DBCO
‑
CC@aPD1。
[0013]本专利技术还有一个目的在于提供一种免疫抑制剂，其特征在于，包括上述任一项所述的制备方法制备得到的修饰型PD
‑
1抗体。
[0014]优选地，所述的修饰型PD
‑
1抗体上所结合的DBCO的个数为0
‑
9个。
[0015]本专利技术还有一个目的在于提供上述任一项的制备方法制备得到的修饰型PD
‑
1抗体或所述的免疫抑制剂在制备用于过继细胞疗法的药物中的应用，以抑制实体瘤的生长，所述过继细胞疗法使用叠氮糖代谢工程标记的T细胞或NK细胞。
[0016]优选地，所述的修饰型PD
‑
1抗体DBCO
‑
CC@aPD1通过与N3的点击化学反应，在体内特异性靶向结合过继的T
‑
N3细胞，多次对体内过继T细胞进行靶向补给，显著增强过继T细胞和aPD1的协同杀伤肿瘤能力。
[0017]优选地，所述的叠氮糖为四酰化N
‑
叠氮基乙酰基氨基半乳糖和四酰化N
‑
叠氮基乙酰基氨基甘露糖两种单糖中的至少一种。
[0018]优选地，所述的叠氮糖为四酰化N
‑
叠氮基乙酰基氨基半乳糖和四酰化N
‑
叠氮基乙酰基氨基甘露糖两本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种修饰型PD
‑
1抗体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法为运用N
‑
羟基丁二酰亚胺功能化的链接剂DBCO
‑
PEG4
‑
NHS与aPD1中的氨基反应，形成修饰型PD
‑
1抗体DBCO
‑
aPD1。2.一种修饰型PD
‑
1抗体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：将N
‑
羟基丁二酰亚胺功能化的链接剂DBCO
‑
PEG4
‑
NHS修饰到细胞色素C上，得到DBCO
‑
CC；运用NHS
‑
S
‑
S
‑
NHS链接剂交联DBCO
‑
CC和aPD1，制备得到修饰型PD
‑
1抗体DBCO
‑
CC@aPD1。3.根据权利要求2所述的修饰型PD
‑
1抗体的制备方法，其特征在于，运用NHS
‑
S
‑
S
‑
NHS链接剂交联DBCO
‑
CC和aPD1，制备得到修饰型PD
‑
1抗体DBCO
‑
CC@aPD1的步骤包括：在aPD1中加入NHS
‑
S
‑
S
‑
NHS，室温条件下在四维旋转仪上反应，将产物转移至超滤管中，离心除去多余未结合的NHS
‑
S
‑
S
‑
NHS，用紫外分光光度计测定aPD1浓度，得到产物aPD1
‑
NHS；在a...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑毅然，马思琪，刘宁，赵磊，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：