特异性结合CD7的抗体及其在制备嵌合抗原受体中的应用制造技术

本发明专利技术公开了特异性结合CD7的抗体。本发明专利技术提供的抗CD7抗体及抗原结合部分均与CD7蛋白具有高亲和性，且结合特异性强。本发明专利技术构建的表达靶向CD7的通用型嵌合抗原受体的T细胞。通过实验验证了该嵌合抗原受体修饰的T细胞对表达CD7的急性淋巴细胞白血病(T

【技术实现步骤摘要】
特异性结合CD7的抗体及其在制备嵌合抗原受体中的应用
[0001]交叉引用说明
[0002]本申请要求于2022年3月29日提交中国专利局、申请号为202210317175.X，专利技术名称为“特异性结合CD7的抗体及其在制备嵌合抗原受体中的应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。


[0003]本专利技术涉及生物医药领域，特别涉及特异性结合CD7的抗体及其在制备嵌合抗原受体中的应用。

技术介绍

[0004]人CD7分子为免疫球蛋白超家族一员，表达于胸腺细胞、NK细胞、90％以上的T细胞表面。目前已有CD7偶联免疫毒素、CD7纳米抗体以靶向白血病/淋巴瘤肿瘤细胞或人体T细胞，以达到肿瘤清除或预防/治疗移植物抗宿主病的目的。此外，亦有研究通过偶联CD7分子与相应蛋白向T细胞递送特定siRNA，以期实现人类免疫缺陷病(HIV)的控制与治疗。虽然CD7分子并非细胞生存必须，但CD7分子在T/NK细胞中执行的具体功能仍未知，仅有少量早期研究提示CD7分子或与TCR激活通路存在相互作用，影响T细胞活化。阐释CD7分子在免疫细胞/肿瘤细胞中发挥的生理/病理功能仍需大量的研究探索。
[0005]近年来，急性T淋巴细胞白血病(T
‑
ALL)患者发病率渐增，患者整体5年生存率仅约50％，儿童患者治愈率略优于成年患者，而成年复发难治患者达长期生存者不足10％。对于复发难治患者，新药的应用效果有限，造血干细胞移植往往成为唯一的治疗选择，但其应用受限于患者疾病状态、骨髓配型结果、移植相关毒性及副作用等诸多因素。因此，此类患者亟需行之有效的新型治疗药物以减轻其疾病负荷，达到疾病缓解或者桥接骨髓移植的治疗目的。
[0006]T
‑
ALL患者其肿瘤细胞多高表达CD2、CD5、CD7等抗原，其中CD7抗原普遍高表达，为抗体治疗及嵌合抗原受体T细胞(CAR
‑
T)免疫疗法提供了治疗靶点。但是，由于患者肿瘤细胞即为异常的T细胞，且患者体内高肿瘤负荷亦抑制正常T细胞增殖，临床治疗中采集患者自体T细胞以制备CAR
‑
T困难重重，潜在肿瘤细胞混杂的问题亦为治疗的安全隐患之一。因此，构建异体来源通用型CAR
‑
T产品以应用于T
‑
ALL的治疗尤为关键。另一方面，由于正常T细胞亦表达CD7抗原(表达阳性率在90％以上)，为了实现CAR
‑
T细胞有效增殖，需要避免细胞间“自相残杀”。现有技术仍有待探索与完善以缺乏解决上述问题，并且效果更优的抗体及嵌合抗原受体仍需进一步研发。因此，寻找该抗体及嵌合抗原受体成为当务之急。

技术实现思路

[0007]本专利技术的一个方面，是针对现有技术中特异性结合CD7的抗体亲和力差的问题，提供了一种特异性结合CD7的抗体及其在制备嵌合抗原受体中的应用。
[0008]本专利技术提供的技术方案为：
[0009]特异性结合CD7的抗体，所述抗体包含如SEQIDNo.1
‑
3所示的轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3序列，和如SEQIDNo.4
‑
6所示的重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3序列，或与所述序列具有80％以上同源性的序列。
[0010]在本专利技术的某些实施方式中，可以对上述互补决定区(CDRs)进行点突变，其目的可以为，例如获得更好的亲和力和/或解离性质，获得更好的表达水平，等，只要其能够与抗原决定簇形成互补结合的结构即可，该突变后的氨基酸序列也视为包含在本专利技术的保护范围之内。
[0011]本专利技术的另一个方面，是提供了一种特异性结合CD7的抗原结合部分，所述抗原结合部分包含如SEQIDNo.1
‑
3所示的轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3序列，和如SEQIDNo.4
‑
6所示的重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3序列，或与上述序列具有80％以上同源性的序列。
[0012]在本专利技术中，上述与其90％以上同源性的，是指与本专利技术中所述核苷酸、氨基酸序列具有90％以上同源性，其可以为具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同源性，可以以合适的方式对本专利技术中所述核苷酸、氨基酸序列进行随机或者工程化的点突变，其目的可以为，例如，获得更好的表达水平、亲和力和/或解离性质，而这些突变后的核苷酸或氨基酸序列均包含在本专利技术的保护范围之内。
[0013]作为优选，在本专利技术的某些实施方式中，上述抗原结合部分可以为Fab、Fab
′
、F(ab
′
)2、Fd、Fv、scFv或单结构域抗体(dAB)，其能够与靶蛋白形成抗原
‑
抗体复合结构。
[0014]更优选地，在本专利技术的一个实施方式中，上述抗原结合部分为scFv。
[0015]在本专利技术的某些实施方式中，上述抗CD7 scFv包含重复个数的VL和VH序列，上述VL和VH序列包含上述CDRs。上述VL和VH之间可以通过合适的连接体/连接肽(Linker)连接，其通常可以由甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)构成，例如，GGGGS。
[0016]在本专利技术的某些实施方式中，上述抗CD7 scFv为一价抗体。在本专利技术的另一些实施方式中，上述轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的重复序列数可以为2或3。当上述重复序列数为2时，上述抗CD7scFv形成二价Diabody的形式；当上述重复序列数为3时，上述抗CD7scFv形成三价Triabody的形式。上述轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)可以以任意合适的顺序连接，例如，N
‑
VL
‑
VH
‑
C、N
‑
VH
‑
VL
‑
C。
[0017]作为优选，在本专利技术的某些实施方式中，上述单价的scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo.7所示，上述述单价的scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo.8所示，或与所述序列具有80％以上同源性的序列。
[0018]更优选地，在本专利技术的一个实施方式中，上述单价的scFv的氨基酸序列如SEQIDNo.9所示，或与其具有80％以上同源性的序列。
[0019]上述特异性结合CD7的抗原结合部分可使用本领域技术人员公知的方法获得，如利用化学试剂处理的方法，或利用蛋白酶消化的方法，如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等，或构建载体在表达系统中表达，或通过合成的方法获得。
[0020]在本专利技术中，可以采用Kohler等在Nature 256:495(1975)中报道的杂交瘤制备方法来制备所述抗体。首先用免疫原(必要时候添加佐剂)免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。
[0021]免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.特异性结合CD7的抗体，其特征在于，所述抗体包含如SEQ ID No.1
‑
3所示的轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3序列，和如SEQ ID No.4
‑
6所示的重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3序列，或与所述序列具有80％以上同源性的序列。2.特异性结合CD7的抗原结合部分，其特征在于，所述抗原结合部分包含如SEQ ID No.1
‑
3所示的轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3序列，和如SEQ ID No.4
‑
6所示的重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3序列，或与上述序列具有80％以上同源性的序列。3.根据权利要求2所述的抗原结合部分，其特征在于，所述抗原结合部分为Fab、Fab
′
、F(ab
′
)2、Fd、Fv、scFv或单结构域抗体(dAB)。4.根据权利要求3所述的抗原结合部分，其特征在于，所述抗原结合部分为scFv，所述scFv为单价、二价或三价的形式；其中，所述单价的scFv的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，所述单价的scFv的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，或与所述序列具有80％以上同源性的序列；优选地，所述单价的scFv的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，或与其具有80％以上同源性的序列。5.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的抗体，或如权利要求2～4任意一项中所述的抗原结合部分。6.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求5所述的多核苷酸的序列。7.一种分离的细胞，其特征在于，所述细胞包含如权利要求1所述的抗体、如权利要求2～4任意一项中所述的抗原结合部分、如权利要求5所述的多核苷酸或如权利要求6所述的载体；所述细胞为选自SP2/0、YB2/0、IR983F、PERC6、CHO细胞系或昆虫细胞系。8.一种嵌合抗原受体，包含胞外区、跨膜区和胞内区，所述胞内区包含胞内信号转导区，其特征在于，所述嵌合抗原受体的胞外区包含CD7结合结构域，所述CD7结合结构域包含如权利要求2～4任意一项中所述的抗原结合部分。9.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外区还包含构建在所述嵌合抗原受体的氨基末端的信号肽或与所述信号肽具有90％以上同源性的氨基酸序列；优选地，所述信号肽为CD8α中的信号肽序列或GM
‑
CSF；更优选地，所述信号肽为如SEQ ID NO.10所示的信号肽。10.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD7结合结构域通过铰链区与所述跨膜区连接；所述铰链区优选为CD8α中的铰链区序列；所述跨膜区为选自以下蛋白质的跨膜结构域或与所述蛋白质具有90％以上同源性的氨基酸序列：T细胞受体的α、β或ζ链、CD2、CD3ε、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD18、CD19、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD48、CD49a、CD49d、CD49f、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD69、CD79A、CD79B、CD84、CD96、CD100、CD103、CD134、CD137、CD150、CD158A、CD158B1、CD158B2、CD158C、CD158D、CD158F1、CD158F2、CD158K、CD160、CD162、CD226、CD229、CD244、CD247、CD258、CD268、CD270、CD272、CD276、CD279、CD314、CD319、CD335、CD336、CD337、CD352、CD353、CD355、CD357、LFA
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1、NKG2C、DAP
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10、ICAM
‑
1、NKp80、IL
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2R beta、IL
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2Rgamma、IL
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7R alpha、LFA
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1、SLAMF9、LAT、GADS、SLP
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76、PAG1/CBP、CD83配体、Fc gamma受体、整联蛋白、激活性NK细胞受体或Toll配体受体，或其组合；优选地，所述跨膜区为CD8α中的跨膜区序列。11.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内区还包含共刺激因子；优选地，所述共刺激因子为通过选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有90％以上同源性的氨基酸序列获得的功能性信号结构域的一种或几种：整联蛋白、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM
‑
1、LFA
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建祥，王敏，谢乐灵，顾闰夏，杨雪，饶青，廖晓龙，
申请(专利权)人：中国医学科学院血液病医院中国医学科学院血液学研究所，
类型：发明
国别省市：