一种抗PIP4K2A剪接变异体多克隆抗体及其在肝癌诊断中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种抗PIP4K2A剪接变异体多克隆抗体及其在肝癌诊断中的应用。所述抗PIP4K2A剪接变异体多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)构建含有重组PIP4K2A剪接变异体基因的重组表达载体，所述重组PIP4K2A剪接变异体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；(2)将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞中诱导表达，获得重组PIP4K2A剪接变异体抗原；(3)将重组PIP4K2A剪接变异体抗原免疫动物，获得抗血清，然后分离纯化获得抗PIP4K2A剪接变异体多克隆抗体。PIP4K2A

【技术实现步骤摘要】
一种抗PIP4K2A剪接变异体多克隆抗体及其在肝癌诊断中的应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种抗PIP4K2A剪接变异体多克隆抗体及其在肝癌诊断中的应用。

技术介绍

[0002]可变剪接(Alternative splicing,AS)可以编辑单个前体mRNA分子，并在真核生物中产生不同的成熟mRNA，这些转录变异体随后可以产生具有不同结构和生物功能的蛋白质。因此，可变剪接是基因表达转录后调控的重要机制，在转录组和编码的蛋白质的多样性中起着至关重要的作用。最近的高通量测序研究表明，95％以上的基因发生可变剪接，并产生至少两种可变的前体mRNA亚型。异常的可变剪接事件可能与多种疾病有关，尤其是在癌症的发生、发展、转移和耐药性等方面。可变剪接事件可作为诊断或预后的生物标志物，以及用于开发癌症的治疗靶点。
[0003]原发性肝癌占我国恶性肿瘤发病率的第四位，致死率高居第二位，严重威胁我国人民的生命和健康。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)(以下简称肝癌)是最常见的成人肝癌，临床上约占原发性肝癌的75％
‑
85％。肝脏血运丰富，早期转移和术后复发是肝癌预后不良的最主要因素。据统计，肝癌的5年生存率仅14.1％，造成肝癌预后不良的根本原因是肝癌早期发病隐匿，缺乏有效的早期诊断方法及早期治疗干预手段。
[0004]PIP4K2A(磷脂酰肌醇
‑5‑
磷酸4
‑
激酶2α)基因全长179.7Kb，包括10个外显子。PIP4K2AcDNA为3.8kb。PIP4K2A蛋白由406个氨基酸组成，分子量为53kDa，在C末端区域具有保守的磷脂酰肌醇磷酸激酶(PIPK)结构域。PIP4K2A属于PIP激酶Ⅱ型，也包括PIP4K2B和PIP4K2C。最初在红细胞中鉴定，并在外周血细胞中高度表达。该蛋白家族的主要功能是识别和磷酸化磷脂酰肌醇(PtdIns)5P，合成磷脂酰肌醇
‑
4,5
‑
二磷酸(PtdIns(4,5)P2)。磷脂酰肌醇
‑
4,5
‑
二磷酸是磷酸肌醇信号转导中的重要前体，可直接调节信号转导蛋白的活性和细胞进程。最近研究表明PIP4K2A参与恶性表型的重要生物学过程的调节，包括细胞增殖、克隆形成和存活。但关于PIP4K2A剪切变异体与肝癌的关系尚未见报道。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中所存在的不足，本专利技术提供了一种抗PIP4K2A剪接变异体的多克隆抗体及其在肝癌诊断中的应用，其解决了现有技术中存在肝癌缺乏有效的早期诊断方法及早期治疗干预手段的问题。
[0006]本专利技术一方面，提供一种抗PIP4K2A剪接变异体多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0007](1)构建含有重组PIP4K2A剪接变异体基因的重组表达载体，所述重组PIP4K2A剪接变异体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0008](2)将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞中诱导表达，获得重组PIP4K2A
剪接变异体抗原；
[0009](3)将重组PIP4K2A剪接变异体抗原免疫动物，获得抗血清，然后分离纯化获得抗PIP4K2A剪接变异体多克隆抗体。
[0010]进一步地，步骤(1)中，所述重组表达载体是将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的片段克隆至原核表达载体获得，优选地，所述原核表达载体为pcDNA3.1
‑
FLAG。
[0011]进一步地，步骤(2)中，所述重组PIP4K2A剪接变异体抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
[0012]进一步地，步骤(2)中，还包括对重组PIP4K2A剪接变异体抗原进行纯化的步骤：利用FLAG
‑
tag亲和层析纯化得到所述PIP4K2A剪接变异体抗原。
[0013]本专利技术另一方面，提供一种抗PIP4K2A剪接变异体多克隆抗体，由上述抗PIP4K2A剪接变异体多克隆抗体的制备方法制备得到。
[0014]本专利技术又一方面，提供一种试剂盒，包括上述一种抗PIP4K2A剪接变异体多克隆抗体。
[0015]本专利技术再一方面，提供上述抗PIP4K2A剪接变异体多克隆抗体、上述试剂盒在制备制备产品中的应用，所述产品的功能为1)
‑
4)中的至少一种：
[0016]1)检测PIP4K2A剪接变异体蛋白；
[0017]2)诊断或辅助诊断肝癌；
[0018]3)诊断或辅助诊断肝癌转移；
[0019]4)判断肝癌预后。
[0020]相比于现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
[0021]本专利技术通过将western blot及免疫组化鉴定了PIP4K2A
‑
S抗体的特异性及有效性，通过实验显示，PIP4K2A
‑
S是促进肝癌转移的独立危险因素，与肝癌患者的生存呈负相关。该实验结果表明PIP4K2A
‑
S可作为肝癌的诊断标志物，因此，检测肝癌患者组织中剪接变异体PIP4K2A
‑
S表达对判断肝癌的预后有着较高的指导意义。
附图说明
[0022]图1为本专利技术实施例1中鉴定PIP4K2A
‑
S抗体特异性的Westernblot图。
[0023]图2为本专利技术实施例2中肝癌组织芯片中PIP4K2A
‑
S的代表性免疫组化图。
[0024]图3为本专利技术实施例2中转移性肝癌患者肿瘤组织中PIP4K2A
‑
S的染色评分图。
[0025]图4为本专利技术实施例2中转移性肝癌患者中不同表达量PIP4K2A
‑
S的生存分析图。
具体实施方式
[0026]下面结合附图及实施例对本专利技术中的技术方案进一步说明。
[0027]实施例1抗AdPIP4K2A
‑
S抗体的制备
[0028]1、重组表达载体构建
[0029]剪接变异体PIP4K2A
‑
S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，根据SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，将缺失5号外显子后形成的4号外显子与6号外显子链接处的氨基酸序列进行氨基酸序列特异性与保守性分析，蛋白可表达性分析以及蛋白抗原性分析后选定抗原区域(剪接变异体PIP4K2A
‑
S蛋白抗原)为：RFGIDDQDFQYIVEC(SEQ ID NO.1)，并进一步将
RFGIDDQDFQYIVEC克隆到修饰的pcDNA3.1
‑
FLAG载体，得到pcDNA3.1
‑
PIP4K2A
‑
S
‑
FLAG粒。具体如下：PCR扩增目的片段PCR体系
[0030][0031]PCR反应条件
[0032][003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗PIP4K2A剪接变异体多克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)构建含有重组PIP4K2A剪接变异体基因的重组表达载体，所述重组PIP4K2A剪接变异体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；(2)将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞中诱导表达，获得重组PIP4K2A剪接变异体抗原；(3)将重组PIP4K2A剪接变异体抗原免疫动物，获得抗血清，然后分离纯化获得抗PIP4K2A剪接变异体多克隆抗体。2.如权利要求1所述的一种抗PIP4K2A剪接变异体多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述重组表达载体是将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的片段克隆至原核表达载体获得，优选地，所述原核表达载体为pcDNA3.1
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FLAG。3.如权利要求1所述的一种抗PIP4K2A剪接变异体多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述重组PIP4K2A剪接变异体抗原的氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂丹，袁静，杨小军，罗杨，刘宇，
申请(专利权)人：重庆市中医院，
类型：发明
国别省市：