针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术属于抗体制备技术领域，尤其涉及针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体及其应用。所述针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体的轻链互补决定区1

【技术实现步骤摘要】
针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及抗体制备
，特别涉及针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体及其应用。

技术介绍

[0002]髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)又称过氧化物酶，是一种溶酶体血蛋白，属于血红素过氧化物酶超家族成员之一，主要来源于多形核中性粒细胞(PMN)、单核细胞和巨噬细胞，贮存在嗜氮颗粒中，是髓系细胞的特异性标志，可通过标记MPO蛋白精确定位和分选髓系细胞。
[0003]研究发现，MPO的主要功能是杀灭吞噬于细胞内的微生物，在受刺激的PMN中，MPO催化次卤酸的产生，主要是生理情况下的次氯酸，以及其他有毒中间体的产生，这些中间体大大提高了PMN杀微生物活性。然而，在特定条件下，MPO催化反应生成过量的氧化剂及其前体(如HOCl、NO2、3
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氯化酪氨酸、酪氨酰基、硝基酪氨酸等)，超过局部抗氧化剂的防御反应时，就会导致氧化应激和氧化性组织损伤。因此，有研究表明MPO有促进冠心病形成的作用。MPO与过氧化氢相互作用，生成一系列具有广泛生物学效应的氧化剂，通过HOCl、NO2氧化途径或通过酪氨酸的硝化作用来氧化修饰低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白中的脂质、载脂蛋白等，导致脂质充填的泡沫细胞形成，胆固醇逆向转运功能受损，从而增大富含胆固醇酯的脂核，促进斑块形成和不稳定性增加。MPO还具有促炎性反应及激活细胞的特性，而这一特性不依赖它的催化活性；MPO与CD11b/CD18整联蛋白结合后黏附于外膜的中性粒细胞，从而激活细胞内信号级联放大，进而促使过氧化物的产生、脱粒和整联蛋白的表达，最终导致动脉粥样硬化(AS)斑块的形成，加速冠心病进展，并引起多种并发症如急性冠脉综合征(ACS)。MPO水平的升高与动脉粥样硬化(AS)和冠心病等不良心血管事件易感性相关，可以作为预测不良心血管事件的一个新兴标志物，临床用于AS和冠心病的辅助诊断和预后评估。
[0004]鉴于MPO蛋白的诊断和标记价值，目前临床上常采用基于抗体的免疫学方法如免疫组织化学法(Immunohistochemistry，IHC)检测细胞和组织中MPO表达水平和定位信息，因此开发特异性好、灵敏度高的抗MPO抗体具有重要意义。然而，目前市售的抗人MPO蛋白抗体的效价偏低、特异性不强，容易导致非特异性染色，进而影响检测结果的准确性，因此，较少有抗体能够满足免疫组织化学法的检测需求。开发特异性强、具备良好MPO蛋白结合能力的单克隆抗体已成为亟待解决的问题。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中抗人MPO蛋白抗体的特异性差、难以用于免疫组织化学检测等问题，本专利技术提供了针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体，并提供了该兔单克隆抗体在制备人MPO蛋白免疫检测试剂和/或试剂盒中的应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术具体通过以下技术方案实现：
[0007]本专利技术第一方面提供了一种针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区，其中：轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示；重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
[0008]进一步地，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括4个框架区，4个所述框架区与3个所述互补决定区按顺序交错排列，构成可变区；所述轻链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO.2所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0009]进一步地，还包括轻链恒定区和重链恒定区，所述轻链恒定区为κ链，所述重链恒定区为IgG1型。
[0010]进一步地，所述兔单克隆抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0011]进一步地，所述兔单克隆抗体为全长抗体或抗体片段，所述抗体片段选自Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、(Fv)2片段、scFv片段和sc(Fv)2片段中的至少一种。
[0012]本专利技术第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子用于编码如上所述的针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体。
[0013]进一步地，所述兔单克隆抗体的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
[0014]本专利技术第三方面提供了一种重组载体，所述重组载体包含如上所述的核酸分子。
[0015]本专利技术第四方面提供了如上所述的针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体、如上所述的核酸分子、如上所述的重组载体在制备人MPO蛋白免疫检测试剂和/或试剂盒中的应用。
[0016]进一步地，免疫检测方法为免疫组织化学法，免疫检测病理组织切片样本包括扁桃体、结肠、结外NK/T细胞淋巴瘤、结肠浸润性腺癌、高级别尿路上皮癌、卵巢浆液性癌、肝、肝细胞癌、肺、肺鳞癌、肺腺癌、乳腺浸润性导管癌、胎盘和小细胞肺癌中的一种或多种。
[0017]本专利技术的优点及积极效果为：
[0018]本专利技术制备得到的具备上述CDR序列的兔单克隆抗体可以识别人细胞或组织表达的天然MPO蛋白，具有良好的特异性和亲和力，用于免疫检测尤其是免疫组织化学法检测时，背景染色干净，基本无非特异性染色，检测MPO蛋白的可靠性好、抗干扰能力强，而且具有分析灵敏度和特异度高等优点，能够有效避免假阳性和假阴性结果，适用于多种病理样本中MPO蛋白的的高准确性和高精度检测。
附图说明
[0019]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0020]图1为本专利技术实施例1构建兔单克隆抗体表达载体所用的载体图谱，从左至右分别为预先携带重链恒定区和抗体轻链恒定区的pRB322载体图谱；
[0021]图2为本专利技术实施例1纯化所得的兔单克隆抗体1F9的凝胶电泳图；
[0022]图3为本专利技术实施例2病理芯片的样本分布图，图中灰色所示为阴性组织，其余为阳性组织；
[0023]图4为本专利技术实施例2利用兔单克隆抗体1F9通过免疫组织化学法检测人扁桃体样本中MPO蛋白的特异性定位和表达情况；
[0024]图5为本专利技术实施例2利用兔单克隆抗体1F9通过免疫组织化学法检测人结肠样本中MPO蛋白的特异性定位和表达情况；
[0025]图6为本专利技术实施例2利用兔单克隆抗体1F9通过免疫组织化学法检测人结肠癌样本中MPO蛋白的特异性定位和表达情况；
[0026]图7为本专利技术实施例2利用兔单克隆抗体1F9通过免疫组织化学法检测人脑(神经元)样本中MPO蛋白的特异性定位和表达情况本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区，其中：轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示；重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。2.根据权利要求1所述的针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括4个框架区，4个所述框架区与3个所述互补决定区按顺序交错排列，构成可变区；所述轻链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO.2所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。3.根据权利要求1所述的针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区，所述轻链恒定区为κ链，所述重链恒定区为IgG1型。4.根据权利要求3所述的针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。5.根据权利要求1或2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李建谋，赵陨石，郭振宇，熊安琪，吴海，徐思丹，
申请(专利权)人：武汉爱博泰克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：