杜鹃兰离体培养与快速繁殖生物技术方法技术

本发明专利技术属于植物离体快繁技术领域，主要提供了紧缺难繁药用植物杜鹃兰的离体培养与快速繁殖的关键生物技术及其在紧缺难繁中药材野生变家种中种子种苗快速繁殖的方法。具体涉及杜鹃兰离体培养及植株生长过程中必需的共生真菌的分离、培养与真菌提取物的制备，杜鹃兰原球茎的诱导、增殖、根和芽的分化及植株生长调控等方法，解决了杜鹃兰人工繁殖的技术难题，为该药材的ＧＡＰ种植奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物离体快繁

技术介绍
杜鹃兰[Cremastra appendiculata(D.Don.)Makino]为兰科杜鹃兰属的野生珍稀药用植物，主要分布于东亚地区，尤以中国的贵州、四川为多(Acta Phytotaxonomica Sinica.2003，41263-266)。以假鳞茎入药，药材称毛慈菇，味辛、甘，性寒，有小毒。有清热解毒、润肺止咳、活血止痛、消肿散结等功效，内用可抗肝癌、乳腺癌、子宫癌等(Journalof Traditional Chinese Medicine.1996，16243-246；Planta Medica.2004，70171-173)，外用于治疮毒、蛇虫咬伤、皮肤烫伤或烧伤等。杜鹃兰自然储量极为稀少，加之无计划的人为采挖，野生资源濒临枯竭。目前该药材的市场需求量上千吨，可野生药材的最大供给量不足100吨，药材价格高达200元/kg。为挽救这一珍稀物种以确保其资源的永续利用，同时也为满足该药材的市场需求，及时开展该药用植物野生变家种的工作便是当务之急。然而，种子种苗的培育是中药材人工种植首先必须解决的关键问题。由于杜鹃兰几乎不能以种子繁殖，假鳞茎是其唯一的繁殖器官。而该植物每个假鳞茎在一年生长期中只能产生1个新的假鳞茎，故繁殖速度极其缓慢，致使人工种植难以规模化进行。加之该植物正常生长需要与特定的真菌共生，更是增加了人工种植的难度。因此，要实现杜鹃兰的人工种植，则必须首先解决其种子种苗的快速高效繁殖技术问题。其次是分离、鉴定其共生真菌的种类并加以培养、利用。近年来，有关兰科植物的组织培养与快速繁殖研究虽取得了突破性进展，但在兰科部分种属的快繁生物技术上仍存在相当大的困难，杜鹃兰的繁殖便是一例。一些研究者尝试了杜鹃兰的组织培养与快速繁殖研究，但几乎都以失败而告终，原因在于没有弄清该植物与真菌共生的特性。从杜鹃兰植株分离的外植体几乎不能产生愈伤组织，而是在适宜条件下形成原球茎，再由原球茎分化出芽和根，进一步发育成植株。原球茎的形成、芽和根的产生、植株生长发育等过程，均需有特定真菌或真菌提取物作用。
技术实现思路
本专利技术解决的主要问题是珍稀紧缺难繁药用植物杜鹃兰的离体快速繁殖技术，即采用现代生物技术获得杜鹃兰原球茎、再生植株及其增殖群体，为按照“中药材生产质量管理规范”(GAP)进行该药用植物的人工种植奠定了基础。本专利技术涉及杜鹃兰的组织细胞代谢与生长发育，离体培养外植体的选择与培养条件的优化及离体培养技术，杜鹃兰的共生真菌种类及其相互作用，共生真菌分离及培养方法，共生真菌提取物制备及成分分析，共生真菌提取物的作用机理等。在本专利技术中，术语“原球茎”是指通过离体培养兰科植物顶端分生组织、腋芽或不定芽所形成的可以分化发育成植株的结构。原球茎是兰科植物组织培养的中间结构，在适宜的培养基上，原球茎可以被扩繁。(一)本专利技术中的材料杜鹃兰[Cremastra appendiculata(D.Don.)Makino]采自其地道产区黔东南，其共生真菌从杜鹃兰植株分离获得。(二)本专利技术的技术方案1.杜鹃兰共生真菌的分离、培养与真菌提取物的制备采集野生杜鹃兰假鳞茎经消毒后，切成小块接种于PDA平皿内，25℃恒温培养，待从切块内长出真菌菌丝后，挑取尖端菌丝纯化培养、鉴定。将分离、纯化的杜鹃兰共生真菌采用麦麸培养基进行液体振荡培养，培养物经双层纱布过滤获得菌丝体。菌丝体经干燥、粉碎后，用甲醇回流法提取以获得浸膏(真菌提取物)。2.杜鹃兰原球茎的诱导培养将新采集的野生杜鹃兰假鳞茎消毒后，切成带1～2个芽眼的小块作为外植体，接种于含有共生真菌提取物的诱导培养基上，其培养基组成为MS+BA(1.0～3.0)mgl-1+2，4-D(0.3～1.0)mgl-1+蔗糖(25.0～35.0)gl-1+共生真菌提取物(5.0～15.0)mgl-1+PVP(0.3～0.6)gl-1+琼脂(6.0～10.0)gl-1，pH5.8～6.0，以培养基中不加共生真菌提取物作为对照。待原球茎长出后，将其用作增殖培养的材料。3.杜鹃兰原球茎增殖培养基的筛选、原球茎增殖培养与植株再生采用正交试验法筛选原球茎增殖的适宜培养基，将诱导所得的杜鹃兰原球茎接种于适宜增殖培养基上，待形成足够的原球茎增殖群体后，再将其转入适于芽和根分化的培养基上以获得再生植株(试管苗)。带根的杜鹃兰试管苗经炼苗后即可移栽。具体实施例方式1.杜鹃兰共生真菌的分离、培养与真菌提取物的制备(1)共生真菌的分离与鉴定分离将新采集的野生杜鹃兰假鳞茎经流水冲洗12h并用无菌水冲洗干净后，切成0.5cm3左右的小块。用75％乙醇表面消毒3～5s，无菌水冲洗3次，再用0.1％HgCl2表面消毒10min，无菌水冲洗5次后，将切块接种于PDA平皿内，25℃恒温培养，待从切块内长出真菌菌丝后，挑取尖端菌丝纯化培养。鉴定已鉴定出2个属的共生真菌。①简梗孢霉属Chromosporium sp.。在麦麸糖培养基上，菌落菌丝初白色、污白色，后黄白色、浅土黄色，短绒毛状。②柱孢霉属Cylindrocarpon sp.I。在麦麸糖培养基上，菌落菌丝白色、污白色至淡黄褐色，短绒毛状。菌丝分泌色素使培养基呈红褐色至黑褐色。(2)共生真菌液体培养及菌丝体收集液体培养采用麦麸培养基麦麸30g，葡萄糖20g，KH2PO40.75g，MgSO41.5g，加水至1000mL。挑取纯化菌丝接种，25℃振荡培养，转速120r/min。培养10～15d后，培养物经双层纱布过滤获得菌丝体，蒸馏水冲洗菌丝体3次，用滤纸吸干水分，干燥后低温保存。(3)共生真菌提取物的制备将干菌丝体粉碎后，甲醇回流提取7次，得浸膏(真菌提取物)，置4℃保存备用。2.杜鹃兰离体培养外植体的选择与原球茎的诱导将新采集的野生杜鹃兰假鳞茎经流水冲洗12h并用无菌水冲洗干净后，用70％乙醇表面消毒1min，无菌水冲洗3次，再用0.1％HgCl2表面消毒10min，无菌水冲洗5次后，将假鳞茎切成带1～2个芽眼的小块作为外植体，无菌条件下接种于150ml容量的装有40ml培养基的三角瓶中。培养基预先在121℃下高压灭菌15min，培养基成分为MS+BA2.0mgl-1+2，4-D 0.5mgl-1+蔗糖30gl-1+共生真菌提取物10mgl-1+PVP 0.5gl-1+琼脂8.0gl-1，pH 5.8，以培养基中不加共生真菌提取物作为对照。25±0.5℃恒温培养，每日光照12h，光照强度为55μmolm-2s-1。约6周左右获得原球茎，将其用作增殖培养的材料。从原球茎的诱导结果发现，在诱导假鳞茎不定芽产生原球茎的培养基中不加共生真菌提取物时，所诱导产生的原球茎数目只有加共生真菌提取物的19.2％(表1)，其生长状况也较差，说明共生真菌或其提取物为杜鹃兰原球茎形成与生长所必需。表1共生真菌提取物对诱导杜鹃兰假鳞茎不定芽产生原球茎的效果诱导培养基 6周后各培养瓶中诱导产生的原球茎数目 原球茎总和基本培养基+共生真13 17 16 18 15 17 15 15 14 16 156菌提取物10mgl-1基本培养基 3 5 1 3 4 2 2 3 4 3 30注①本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种杜鹃兰再生植株，其特征在于：它由杜鹃兰假鳞茎诱导的原球茎分化而来。

【技术特征摘要】
1.一种杜鹃兰再生植株，其特征在于它由杜鹃兰假鳞茎诱导的原球茎分化而来。2.权利要求1所述的杜鹃兰再生植株的诱导分化方法，其特征由以下步骤构成(1)原球茎的诱导(2)原球茎的增殖(3)原球茎的分化(4)试管苗的生长该四个过程均需要在其培养基中加入杜鹃兰共生真菌提取物。3.权利要求2中所述的培养基，其特征在于原球茎诱导和增殖培养基均为MS+BA(1.0～3.0)mg l-1+2，4-D(0.3～1.0)mg l-1+蔗糖(25.0～35.0)g l-1+共生真菌提取物(5.0～15.0)mg l-1+PVP(0.3～0.6)g l-1+琼脂(6.0～10.0)g l-1；芽和根分化及试管苗生长的培养基为1/2 MS+NAA(0.3～0.6)mg l-1+IBA(0.3～0.8)m...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明生，杨永华，吉晓佳，姜晓宏，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]