一种鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的方法技术

本发明专利技术涉及禽类胚胎成肌细胞培养技术领域，具体涉及一种鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的方法，该方法冻存的鸽胚成肌细胞的增殖分化能力良好，使得鸽肌肉发育相关的研究有了体外模型，并且鸽胚成肌细胞的体外培养不受时空的影响；并且，本发明专利技术通过比对37℃和39℃两个培养温度下鸽胚成肌细胞的生长速度和情况，探索出鸽胚成肌细胞的最适培养温度，为后续优化鸽胚成肌细胞的体外培养效率提供了有益借鉴。供了有益借鉴。供了有益借鉴。

【技术实现步骤摘要】
一种鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的方法


[0001]本专利技术涉及禽类胚胎成肌细胞培养
，具体涉及一种鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的方法。

技术介绍

[0002]鸽子具备较高的经济价值，且鸽肉的营养价值相对于其他家禽来说更高，因此受到许多食客的喜爱，目前许多地区的养鸽业已经成为了新的地区经济增长点。鸽子的可食用肉主要集中于胸肌，占到了总体重的20％～40％，因此，为了满足市场的需求，提高鸽子胸肌产肉量是育种的方向。
[0003]为了提高鸽子的胸肌产肉率，分子育种是最快且高效的方法。成肌细胞作为骨骼肌的前体细胞，其在胚胎期的数量直接影响着肌肉的产量。因此，在胚胎期控制成肌细胞的增殖和分化程度，可以有效提高鸽子的产肉率，从而满足市场的需求。
[0004]由于在分子育种中，需要对鸽胚成肌细胞进行基因功能的体外验证，但目前其分离培养、冻存、复苏和传代方法仍鲜见报道，因此，开发一种鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的方法具有迫切的现实意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，而提供一种鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的方法，该方法为鸽肌肉发育建立了体外培养模型，并且鸽胚成肌细胞的体外培养不受时空的影响。
[0006]本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
[0007]提供一种鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的方法，包括以下步骤：
[0008]步骤a、选取欧洲肉鸽鸽胚，对其进行成肌细胞的分离，具体操作为：
[0009]采用0.25％胰酶将鸽子胸肌组织消化5～10min，而后终止消化，在4℃、800～1000r/min条件下离心、弃上清后得到成肌细胞，加入增殖培养基重悬后计数，调整细胞密度为5.8
×
105～6.2
×
105；
[0010]步骤b、对分离好的成肌细胞分别进行37℃和39℃的纯化培养后，吸出上清液，用增殖培养基进行增殖培养；
[0011]步骤c、当步骤b培养到细胞密度为70～80％后，更换分化培养基进行诱导分化并进行鉴定；
[0012]步骤d、对步骤b中纯化后的细胞悬液冻存液进行冻存，具体操作为：
[0013]采用0.25％胰酶将细胞消化5～10min，终止消化后，在4℃、800～1000r/min条件下离心，弃上清后得到细胞，加入增殖培养基重悬后计数，然后调整细胞密度至5.8
×
105～6.2
×
105后，向细胞悬液中加入冻存液并计数，装入冻存管中放入冻存盒，在
‑
80℃下经过24h转入液氮冻存；
[0014]步骤e、对冻存的细胞进行复苏培养，具体操作为：
[0015]取出冻存的细胞，放入37℃水浴锅迅速解冻后加入增殖培养基，4℃、1000r/min离心，弃上清后加入增殖培养基重悬并计数，而后调整细胞密度至5.8
×
105～6.2
×
105后，接种到培养皿或培养瓶进行增殖培养；
[0016]步骤f、对复苏细胞培养到密度为70～80％后，进行传代操作，具体操作为：
[0017]采用0.25％胰酶将贴壁细胞消化2～3min，终止消化后，在4℃、800
‑
1000r/min条件下离心，弃上清后得到细胞，然后加入增殖培养基重悬并计数，调整细胞密度至5.8
×
105～6.2
×
105后进行布板。
[0018]上述技术方案中，步骤a中，选取13日龄的欧洲肉鸽米玛斯品系鸽胚。
[0019]上述技术方案中，步骤b中，通过对比两个培养温度下鸽胚成肌细胞的生长速度和情况，得出培养鸽胚成肌细胞的最适温度为39℃。
[0020]上述技术方案中，步骤c中，在细胞诱导分化48h后，对其进行MyHC免疫荧光实验和MyoG、Myh1基因的定量分析，检测其是否为成肌细胞。
[0021]上述技术方案中，步骤d中，向细胞悬液中加入10％的冻存液DMSO，采用缓慢降温的方式在
‑
80℃冰箱降温24h后转入液氮进行保存。
[0022]上述技术方案中，步骤e中，向迅速解冻后的冻存细胞中加入10倍体积量的增殖培养基。
[0023]上述技术方案中，所述增殖培养基是由按体积百分比计的20％FBS、1％双抗和79％的DMEM
‑
F12组成。
[0024]本专利技术的有益效果：
[0025](1)本专利技术首次建立了对鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的办法，该方法冻存的鸽胚成肌细胞的增殖分化能力良好，使得鸽肌肉发育相关的研究有了体外模型，并且鸽胚成肌细胞的体外培养不受时空的影响；
[0026](2)本专利技术通过比对37℃和39℃两个培养温度下鸽胚成肌细胞的生长速度和情况，发现了39℃对鸽胚成肌细胞的增殖速度显著高于37℃，探索出鸽胚成肌细胞的最适培养温度，为后续优化鸽胚成肌细胞的体外培养效率提供了有益借鉴。
附图说明
[0027]图1是经过分离纯化培养的增殖期48h以及分化期24、36h鸽胚成肌细胞情况图(图中标尺均为100μm)。
[0028]图2是进行诱导分化48h的成肌细胞鉴定结果(图中标尺均为400μm)，其中蓝色是DAPI染色所显示的细胞核，绿色是免疫荧光所显示的骨骼肌的主要结构和收缩蛋白
‑
MyHC蛋白即形成肌管的标志物。
[0029]图3是将细胞从存放冻存管的冻存盒转入液氮进行保存和复苏的操作示意图，其中图A为将冻存细胞的冻存管放入冻存盒在
‑
80℃冻存24h的操作图；图B为转入液氮保存的操作图；图C为将冻存细胞在37℃水浴锅中摇动解冻的操作图。
[0030]图4是冻存细胞复苏增殖48h、分化培养12、36h的情况图(图中标尺均为100μm)。
[0031]图5是冻存细胞的分化48h鉴定结果图(图中标尺均为200μm)。
[0032]图6是冻存细胞传代增殖期48h培养以及分化期24、48h的情况图(图中标尺均为200μm)。
[0033]图7是不同温度下鸽胚成肌细胞增殖48h后的EdU染色对比图(图A)以及增殖率(细胞增殖个数/所有细胞个数)对比图(图B)。
[0034]图8是不同温度下鸽胚成肌细胞分化48h的MyHC免疫荧光对比图(图A)以及肌管融合率(融合的细胞核数/总细胞核数)对比图(图B)，图中标尺均为200μm。
[0035]图9是不同温度下培养的鸽胚增殖和分化主要调控基因的相对定量结果图，其中：图A分别是分化48h的成肌细胞增殖期主要调控基因MyoD、Myf5基因的RT
‑
qPCR检测分析对比图；图B分别是分化48h的成肌细胞的主要调控基因Myh1、MyoG基因的RT
‑
qPCR检测分析对比图。
具体实施方式
[0036]结合以下实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鸽胚成肌细胞的分离培养、冻存、复苏和传代的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤a、选取欧洲肉鸽鸽胚，对其进行成肌细胞的分离，具体操作为：采用0.25％胰酶将鸽子胸肌组织消化5～10min，而后终止消化，在4℃、800～1000r/min条件下离心、弃上清后得到成肌细胞，加入增殖培养基重悬后计数，调整细胞密度为5.8
×
105～6.2
×
105；步骤b、对分离好的成肌细胞分别进行37℃和39℃的纯化培养后，吸出上清液，用增殖培养基进行增殖培养；步骤c、当步骤b培养到细胞密度为70～80％后，更换分化培养基进行诱导分化并进行鉴定；步骤d、对步骤b中纯化后的细胞悬液冻存液进行冻存，具体操作为：采用0.25％胰酶将细胞消化5～10min，终止消化后，在4℃、800～1000r/min条件下离心，弃上清后得到细胞，加入增殖培养基重悬后计数，然后调整细胞密度至5.8
×
105～6.2
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105后，向细胞悬液中加入冻存液并计数，装入冻存管中放入冻存盒，在
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80℃下经过24h转入液氮冻存；步骤e、对冻存的细胞进行复苏培养，具体操作为：取出冻存的细胞，放入37℃水浴锅迅速解冻后加入增殖培养基，4℃、1000r/min离心，弃上清后加入增殖培养基重悬并计数，而后调整细胞密度至5.8
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105～6.2
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105后，接种到培养皿或培养瓶进行增殖培养；步骤f、对复苏细胞培养到密度为70～80％后，进行传代操作，具体操作为：采用0...

【专利技术属性】
技术研发人员：张续勐，朱辰语，黄运茂，王梓颖，肖小烽，常楷悦，伍仲平，梁雅妍，陈益填，沈栩，李秀金，
申请(专利权)人：梅州市金绿现代农业发展有限公司，
类型：发明
国别省市：