一种根癌农杆菌介导的黑木相思高效遗传转化体系及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种根癌农杆菌介导的黑木相思高效遗传转化体系及其构建方法，以黑木相思优良无性系SR3茎段为外植体，并研制不定芽诱导的培养基，采用含有重组农杆菌的侵染液侵染黑木相思不经过预培养的茎段，然后进行浸染和共培养，将外植体进行转基因株系的诱导和筛选培养，得到黑木相思抗性芽，再筛选得到完成遗传转化的黑木相思阳性植株。其中，通过对实验条件的优化来提高不定芽的诱导率以及获得高效的遗传转化；本发明专利技术为本源植物的基因导入和敲除等功能研究提供技术支持，有利于解析黑木相思心材形成、发育等的分子机理，为黑木相思重要基因的功能解析提供参考，且可以在黑木相思优良无性系的基础上进一步获得转基因和基因编辑新品种。基因编辑新品种。基因编辑新品种。

【技术实现步骤摘要】
一种根癌农杆菌介导的黑木相思高效遗传转化体系及其构建方法


[0001]本专利技术涉及植物基因工程的
，具体涉及一种根癌农杆菌介导的黑木相思高效遗传转化体系及其构建方法。

技术介绍

[0002]黑木相思是含羞草科(Mimosaceae)金合欢属(Acacia)高大常绿乔木，原产于澳大利亚。作为澳大利亚著名的珍贵树种，黑木相思与胡桃木、红木和柚木是作为大规模产出的四大珍贵用材树种，由于木材密度高、纹理好，常作为优良的实木家具、贴面板和细木工材，目前广泛的在大洋洲、欧洲、亚洲、非洲引种。20世纪90年代引进我国，因其速生、材质好，具有固氮根瘤，枯落物丰富，改土性能好等优点，后期通过选育和改良，已选育出生长速度快、干形通直、心材率高的优良无性系，目前已大量繁殖和栽培，现已发展成为我国华南地区种植的中短周期、生态友好型珍贵树种。
[0003]但目前对黑木相思的研究主要是开展了无性系选育、栽培技术、组培繁殖技术等研究，开展了愈伤组织诱导和不定芽再生的研究较少，国内外尚未开展相关遗传转化体系建立的研究，尤其缺乏针对栽培的优良无性系开展的遗传转化体系的研究。研究以黑木相思广泛栽培的优良无性系SR3组培苗茎段为材料，通过对再生培养基的研制建立高频率再生体系，在此基础上采用根癌农杆菌介导的遗传转化体系的优化，最终通过筛选和鉴定，获得稳定转化的转基因芽苗，建立高效的黑木相思优良无性系遗传转化体系，为进一步的黑木相思改良和转基因新品系的培育奠定基础。

技术实现思路

[0004]针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种根癌农杆菌介导的黑木相思高效遗传转化体系及其构建方法。
[0005]本专利技术的
技术实现思路
如下：
[0006]本专利技术提供一种根癌农杆菌介导的黑木相思高效遗传转化体系的构建方法，包含以下步骤：
[0007]步骤1：侵染根癌农杆菌菌株：挑取活化后的农杆菌单菌落，转接到LB液体培养基中，在28℃和200rpm恒温摇床中培养16
‑
24h至菌液OD600值为0.5，4℃离心10min，移除上清，加入等体积的WPM+30g
·
L
‑1的蔗糖重悬液将沉淀的菌体重新悬浮；
[0008]所述的活化为将农杆菌菌株在含有30mg
·
L
‑1利福平和50mg
·
L
‑1Kan的平板上三级划线进行活化；
[0009]所述农杆菌菌株的制备为：从
‑
80℃冰箱取出保存的根癌农杆菌GV3101感受态(购自上海唯地生物)，插在冰上，待其融化到冰水混合状态时，向100μL的感受态中加入1μL的pBI121质粒(浙江农林大学卢孟柱教授赠送)5min，然后将其转入液氮中速冻5min，从液氮中取出后，平稳地放入37℃水浴锅中热激5min，加入700μLLB液体培养基，吹打混匀后28℃，
200rpm振荡培养2h，将复苏完的菌液6000rpm离心1min，弃上清液，留100μL左右上清液用移液枪轻轻吹打混匀，取50μL菌液涂布于含有50mg
·
L
‑1Kan20mg
·
L
‑1Rif的LB28℃倒置培养2
‑
3d；
[0010]步骤2：将切取的外植体茎段用农杆菌浸染：将切取的外植体茎段放置在重悬浮的农杆菌菌液中浸泡20min并轻微晃动5
‑
6次后，取出吸取表面菌液，转移到表面铺有无菌滤纸的pH为5.4的共培养培养基上暗培养48h；
[0011]所述的外植体的获取预处理为：取黑木相思优良无性系无菌增殖苗在增殖培养基上培养25
‑
30d，植物光照强度为100～300μmol
·
m
‑2·
s
‑1，时间为16h，培养室温度为23
±
2℃；
[0012]所述的增殖培养基包含：mMS培养基、0.3mg
·
L
‑1BAP、0.2mg
·
L
‑1IBA、0.2mg
·
L
‑1IAA、30g
·
L
‑1蔗糖和7.0g
·
L
‑1琼脂；
[0013]所述的外植体茎段的切取为：取苗高超过3cm的黑木相思芽苗，去除带有腋芽的茎段，切取0.5
‑
1cm茎段作为外植体备用；
[0014]所述的共培养基包含WPM、0.10mg
·
L
‑1TDZ、0.05mg
·
L
‑1IAA、200.0μM乙酰丁香酮、30.0g
·
L
‑1蔗糖和7.0g
·
L
‑1琼脂粉。
[0015]步骤3：筛选培养外植体抗性芽：将共培养后的茎段转移到添加有200mg
·
L
‑1Cef和30mg
·
L
‑1Kan的愈伤组织诱导培养基上进行筛选培养，每隔2个星期更换一下培养基，更换时去除褐化、死去的外植体，得到带有芽点的外植体；
[0016]所述的愈伤组织诱导培养基的PH为5.8，包含WPM、0.10mg
·
L
‑1TDZ、0.05mg
·
L
‑1IAA、0.10mg
·
L
‑1AgNO3、30.0g
·
L
‑1蔗糖和7.0g
·
L
‑1琼脂粉；
[0017]步骤4：将带有芽点的外植体进行筛选培养和检测；
[0018]所述的抗性植物的筛选培养为将带有芽点的外植体转移至添加200mg
·
L
‑1Cef和30mg
·
L
‑1Kan的增殖培养基中进行不定芽诱导和伸长培养20天至抗性芽伸长到3
‑
5cm；
[0019]所述的检测的方法为DNA提取、PCR扩增和GUS染色：在超净工作台剪取生根苗的部分叶片并做好标记进行DNA提取，采用CTAB法进行DNA提取，采用NPTII和GUS基因特异引物进行PCR扩增。同时扩增出目的条带的株系证明为稳定整合到黑木相思核基因组的转基因株系，同时使用GUS染色对检测出来的株系进行进一步确定，确保GUS基因的表达。
[0020]有益效果：
[0021]本专利技术提供一种根癌农杆菌介导的黑木相思高效遗传转化体系的构建方法，以黑木相思为材料，利用黑木相思广泛栽培的优良无性系SR3增殖组培芽苗茎节间为受体，并研制不定芽诱导的培养基，通过添加植物生长调节剂、硝酸银等配方的研制，建立其茎段诱导的丛生不定芽再生体系，其中，添加有TDZ的WPM培养基对丛生芽具有很高的诱导性，添加的IAA和硝酸银能够大幅度提高黑木相思不定芽的再生率，IAA对不定芽诱导率最高达到75％，硝酸银对不定芽的诱导再生率达到85％，并用30mg
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种根癌农杆菌介导的黑木相思高效遗传转化体系的构建方法，其特征在于，包含以下步骤：步骤1：侵染根癌农杆菌：挑取活化后的农杆菌单菌落，转接到LB液体培养基中，在恒温摇床中培养16
‑
24h至菌液OD600值为0.5，离心，移除上清，加入等体积的WPM+的蔗糖重悬液将沉淀的菌体重新悬浮；步骤2：将切取的外植体茎段用农杆菌浸染：将切取的外植体茎段放置在重悬浮的农杆菌菌液中浸泡并轻微晃动，取出吸取表面菌液，转移到表面铺有无菌滤纸的共培养培养基上暗培养；步骤3：筛选培养外植体抗性芽：将共培养后的茎段转移到添加在含有Cef和Kan的愈伤组织诱导培养基上进行筛选培养，定期更换一下培养基，更换时去除褐化、死去的外植体，得到带有芽点的外植体；步骤4：将带有芽点的外植体进行筛选培养和检测。2.根据权利要求1所述的一种根癌农杆菌介导的黑木相思高效遗传转化体系的构建方法，其特征在于，所述的农杆菌为携带GUS基因的pBI121质粒的GV3101农杆菌菌株。3.根据权利要求1所述的一种根癌农杆菌介导的黑木相思高效遗传转化体系的构建方法，其特征在于，步骤1所述农杆菌的活化操作为将农杆菌在含有30mg
·
L
‑1利福平和50mg
·
L
‑1Kan的平板上三级划线进行活化。4.根据权利要求1所述的一种根癌农杆菌介导的黑木相思高效遗传转化体系的构建方法，其特征在于，步骤2所述外植体获取预处理为：将黑木相思优良无性系无菌增殖苗在增殖培养基上培养25
‑
30d，植物光照强度为100～300μmol
·
m
‑2·
s
‑1，时间为16h，培养室温度为23
±
2℃。5.根据权利要求4所述的一种根癌农杆菌介导的黑木相思高效遗传转化体系的构建方法，其特征在于，所述的增殖培养基包含：mMS培养基、0.3mg
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‑1BAP、0.2mg
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L
‑1IBA、0.2mg
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【专利技术属性】
技术研发人员：范春节，曾炳山，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院热带林业研究所，
类型：发明
国别省市：