一种通过注射在体枇杷果实实现基因瞬时表达的方法技术

本发明专利技术提供一种通过注射在体枇杷果实实现基因瞬时表达的方法，该方法包括：(1)枇杷果实选择；(2)注射在体枇杷果实；(3)瞬时表达果实表达量分析和表型分析。本发明专利技术通过注射的方式使目的基因在枇杷果肉组织中瞬时表达，可用于但不限于目的基因功能的研究。本发明专利技术采用的在体枇杷果实基因瞬时表达的方法，弥补了枇杷缺乏用于基因功能验证的稳定转化体系的不足，实现了在体枇杷果实的整果渗透，快速高效地进行体枇杷果实目的基因功能的同源验证。行体枇杷果实目的基因功能的同源验证。

【技术实现步骤摘要】
一种通过注射在体枇杷果实实现基因瞬时表达的方法


[0001]本专利技术属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及一种通过注射在体枇杷果实实现基因瞬时表达的方法，是一种将目标基因在枇杷在体果实中实现瞬时表达的方法。

技术介绍

[0002]枇杷(Eriobotrya japonica)属于蔷薇科(Rosaceae)枇杷属(Eriobotrya)植物，是我国南方的重要特色经济果树。枇杷原产于中国，随着枇杷种植业的不断发展，尤其是近几年的快速扩展，经济效益不断提高，有关枇杷产业的基础研究也在提速推进。但是对于多年生木本果树，由于其快繁效率低，且生长周期长等原因，无法获得稳定转基因的果实，且迄今仍未见有枇杷稳定转基因体系的相关报道，限制了基于枇杷同源基因功能验证的相关研究与探究。
[0003]基因瞬时表达是指目的基因通过一系列方法导入宿主细胞后，并不整合到宿主细胞的基因组DNA上，只是利用宿主细胞的蛋白表达体系，在一段时间内表达目的基因。这种表达会随着宿主细胞的不断分裂清除，具有一定的时效性，因此被称为瞬时表达。对比于稳定表达体系，瞬时表达的操作比较简单，周期短，可以快速的验证基因功能。目前常见的基因瞬时表达方法有基因枪法和农杆菌转化法。然而基因枪法对于设备要求较高，且转化效率低，也难以实现田间实时操作。因此，研究者通常选用农杆菌转化法进行基因瞬时表达。
[0004]果实相关基因功能研究中经常使用的农杆菌转化法，包括在体和离体，有直接注射法，真空渗透法、高压高速注射等方法。已有的果肉注射方法常会导致侵染范围的有限，农杆菌悬液只能在局部果肉渗透，同时枇杷果实容易发生褐变和腐烂，不适用离体注射；真空渗透法有一定的仪器要求以及无菌操作环境的要求；高压高速注射法不但渗透范围小，高速的液柱影响果实正常发育。所以目前仍然缺乏一种对枇杷果实现快速，高效，简便的基因瞬时表达体系。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种通过注射实现对在体枇杷果实整果渗透的方法，可以但不限于用于基因瞬时表达以验证基因功能，通过以下步骤实现：
[0006](1)枇杷果实选择：根据需求选择不同发育阶段的成熟度一致的枇杷果实作为基因瞬时表达材料和对照材料，果实材料的选择为在体枇杷果实。具体为：枇杷果实成熟度根据目的基因在发育阶段的表达情况选择，包括小绿果(盛花后约55天)和大绿果(盛花后约95天)时期的枇杷果实。
[0007]具体果实挑选方法为：选取同一向阳枝条上大小，形状，成熟度一致且没有机械损伤的两个果实为一组，去除该结果枝上的其他果实。保留的两个果实中一个为对照果实，另一个为试验果实，并以此为一个生物学重复，试验共需至少3个生物学重复。
[0008](2)注射在体枇杷果实：将提前配置好的农杆菌侵染液，对步骤(1)中选取的果实使用带针头的一次性无菌注射器，从果实果柄下方进行注射。其中两个果实，一个注射携带
空载载体的农杆菌作为空白对照，另一个注射携带重组质粒的农杆菌(农杆菌菌体重悬液)作为试验处理。该步骤完成后可以观察到果实表面有菌液渗出。
[0009]具体操作步骤如下：使用带针头的一次性无菌注射器吸取适量的菌体重悬液，在果柄处下方1
‑
2毫米处将针头扎入适当深度，缓慢推动注射器，使菌液慢慢的将果肉组织渗透，注射完成后能观察到果实表面有菌液渗出。
[0010]注射液体包括但不限于农杆菌菌体重悬液。
[0011](3)瞬时表达果实表达量分析和表型分析：步骤2注射后的在体枇杷果实保留在枝条上自然生长7天后摘下，去除种子以后保留果肉，用液氮冻存，用于基因表达量分析和表型分析。
[0012]本专利技术的另一个目的是提供所述方法在枇杷果实中进行目的基因功能同源验证中应用。本专利技术方法实现了在体枇杷果实的整果渗透，用于基因功能同源验证。
[0013]本专利技术提出了一种新的枇杷果实注射方法，是枇杷果实基因瞬时表达的方法，弥补了枇杷缺乏用于基因功能验证的稳定转化体系的不足，实现了农杆菌对枇杷果实整果的渗透，解决了其他注射方法中渗透范围有限等问题，为枇杷果实相关目的基因功能的同源验证提供了一种快速，高效的新途径。
附图说明
[0014]图1.注射示意图，注射完成后果实表面有液体渗出。
[0015]图2.注射不同成熟度枇杷果实扩散范围示意图，在小绿果和大绿果阶段均可实现整果渗透。
[0016]图3.注射枇杷果实选择示意图。
[0017]图4.农杆菌侵染后枇杷果实表型和表达分析，SK为注射携带空白pGreen II 0029 62
‑
SK载体农杆菌的对照枇杷果实，SK
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EjPDS为注射携带有重组质粒农杆菌的过表达枇杷果实。
具体实施方式
[0018]下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步阐述，但实施例不限制本专利技术的保护范围。
[0019]实施例1：本实施例通过预试验注射染料以标记注射液在枇杷果实中的渗透范围
[0020](一)试验方法分别选取枇杷小绿果和大绿果为材料，用1mL一次性无菌注射器吸取黑色墨汁。在枇杷果实果柄下方将墨汁缓慢注射进入枇杷果实中，小绿果的注射量约为1mL，大绿果注射量约为3mL，注射成功后枇杷果实表面有液体渗出(附图1)。将注射后的枇杷果实切开以后观察果肉染色情况以判断侵染液的渗透情况。
[0021](二)试验结果如(附图2)所示，未注射的枇杷小绿果和大绿果果实果肉呈现浅绿色或黄绿色，注射后对应枇杷果实果肉完全呈现为黑色或者灰色。表明，本申请的试验方法不管是对于枇杷的小绿果还是大绿果时期，都可以实现整果渗透。
[0022]实施例2：本实施例通过瞬时过表达枇杷类胡萝卜素合成途径中的关键酶—八氢番茄红素脱氢酶(EjPDS)，介绍一种在体枇杷果实基因瞬时表达的方法
[0023](一)试验方法
[0024]步骤1：克隆待验证的目的基因。
[0025](1)称取1g的
‘
大红袍
’
枇杷果实粉末，使用CTAB法提取枇杷果实总RNA，使用诺唯赞R323
‑
01 qPCR cDNA逆转录试剂盒反转录获得枇杷果实cDNA，并以此作为PCR模板。
[0026](2)根据枇杷基因组中的EjPDS序列作为参考序列，设计带有载体同源序列的克隆引物，以步骤1
‑
(1)中获得的cDNA为模板进行PCR扩增和琼脂糖电泳，获得特异条带并切胶回收，回收产物送测获得目的基因的实际序列信息，比对后实际序列和参考基因组序列一致。
[0027]步骤(1)
‑
(2)所述的枇杷基因组EjPDS参考序列为：5
’‑
ATGGCGCAGTGGGCTT GTGCCTCCGCTGCTAACTTGAGCTACCAAGCTACCATCGTAAACACTCAGAAGCAACGAAACAGTCCCGGATGCGATTCCTTTTCTTTCAAAGGCAGTGAATTTATGGC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过注射在体枇杷果实实现基因瞬时表达的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)枇杷果实选择：选取同一向阳枝条上大小，形状，成熟度一致且没有机械损伤的两个果实为一组，去除该结果枝上的其他果实，一组果实为一个生物学重复，试验共需至少3个生物学重复；(2)注射在体枇杷果实：将提前配置的农杆菌侵染液，使用一次性无菌注射器从步骤(1)中选取果实的果柄下方处进行注射，注射携带空载载体的农杆菌作为空白对照组，注射携带重组质粒的农杆菌作为试验处理组，该步骤完成后可以观察到果实表面有菌液渗出；(3)瞬时表达果实表达量分析和表型分析：步骤(2)注射后的体枇杷果实保留在枝条上自然生长7天后摘下，去除种子以后果肉用液氮冻存，用于基因表达量分析和表型分析。2.根据权利要求1所述的一种通过注射在体枇杷果实实现基因瞬时表达的方法，其特征在于，步骤(1)中的果实材料的选择为在体枇杷果实。3.根据权利要求1所述的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：石艳娜，梁梓豪，陈昆松，黄艺清，朱长青，吴迪，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：