一种用于骨干载体的RNAi表达框及相应载体和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于骨干载体的RNAi表达框及相应载体和应用。本发明专利技术的表达框可以抑制MLH1基因表达并且实现了引导编辑后将其切除。本发明专利技术的骨干载体包括融合蛋白、pegRNA和OsMLH RNAi表达框和激活Cre重组酶表达的表达框；所述融合蛋白为Cas9切刻酶或其变体、反转录酶组成的融合蛋白。pegRNA包含靶向目的DNA片段的sgRNA、逆转录模板和引物结合位点、连接得到的RNA分子。本发明专利技术所述的骨干质粒载体中，pegRNA表达框和融合蛋白表达框、OsMLH RNAi表达框及Cre表达框位于同一双元载体中。本发明专利技术的PE

【技术实现步骤摘要】
一种用于骨干载体的RNAi表达框及相应载体和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及提高引导编辑系统的编辑效率并且提供纯合品种的表达框、载体及其在基因组编辑中的应用。

技术介绍

[0002]2019年David Liu课题组利用Cas9
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H840A蛋白融合逆转录酶MMLV，通过在单链引导RNA的3
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端引入引物结合位点PBS(Prime Binding Sites)和逆转录模板RT(Reverse Template)实现突变的精准获得，其中PBS识别非靶标链并结合，RT上携带预设突变进行逆转录，经DNA断裂后修复将突变精准的整合到基因组上。融合了PBS和RT的单链引导RNA命名为PegRNA。引导编辑系统具有更精准和可操作性强等优势，但是引导编辑的效率显著低于敲除和碱基编辑系统。随后，科学家们致力于引导编辑系统效率的优化工作:从稳定和增强PegRNA表达角度出发，目前已知的策略主要有：1.PegRNA的3
’
端融合Motif基团稳定PegRNA的结构和减少3
’
端PBS和RT序列被降解；2.使用双PegRNA系统提高引导编辑效率，同时兼顾了PBS的退火温度等。3.通过使用复合型启动子增强PegRNA的表达。4.在RT模板序列上置入无义的碱基突变，减少与野生型序列互补配对的干扰，从而稳定PegRNA的结构。而优化另一重要结构域的策略也有许多报道，通过将nCas9蛋白点突变为nCas9
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R221K,N394K稳定Cas9
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MMLV的复合体结构；同样的可以采取使用多肽来稳定结构和表达。
[0003]但是现有策略要么引导编辑效率偏低，难以应用，要么无法提供纯合的植物品种。

技术实现思路

[0004]针对上述问题，本申请的专利技术人在通过大量实验研究之后，研发出了一种用于骨干载体的RNAi表达框，其可以抑制水稻本身MLH1基因的表达量，并且通过与另一表达框的配合能够实现自切除。动植物的机体为了抵御突变的引入，会启动错配修复途径进行修复。而MLH1基因是错配修复途径的关键因子，本申请在突变引入的关键时刻将该基因干扰，使得错配修复无法工作，有利于突变的引入，进而提升突变效率。本专利技术提供的表达框及相应载体既能够通过抑制水稻本身MLH1基因的表达量提高植物引导编辑系统的精确编辑效率，同时当实现这一目的后为了不影响MLH1抑制后对表型的影响，将MLH1干扰的表达框通过干旱诱导的Cre
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loxp系统进行切除，进而避免抑制MLH1之后带来植株生长问题，进而有利于纯合突变体的获得。
[0005]具体而言，本专利技术提供一种用于骨干载体的RNAi表达框，所述表达框包含启动子、MLH基因互补序列、Nos终止子序列，其中，所述启动子序列如序列表中SEQ ID No.1的第59
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2048位所示，所述MLH基因互补序列如序列表中SEQ ID No.1序列表1的2058
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2788位所示，所述Nos终止子序列如序列表中SEQ IDNo.1的2902
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3154位所示。
[0006]一种用于切除上述表达框的重组酶表达框，所述表达框包含干旱诱导的Rab17启动子序列、Cre重组酶和终止子序列，所述Rab17干旱诱导启动子如序列表中SEQ ID No.1的第3160
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4137位所示，Cre重组酶如序列表中SEQ ID No.1的第4140
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5365位所示，3At终止子
如序列表中SEQ ID No.1的第5380
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5849位所示。
[0007]进一步地，所述重组酶表达框的特异识别位点包含方向一致的重组酶特异识别位点LoxP，二者分别位于序列表1的1
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34位和5879
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5912位。
[0008]另一方面，本专利技术提供一种植物骨干载体，所述植物骨干载体包括权利要求1所述的抑制MLH基因表达的表达框和权利要求2所述的重组酶表达框。
[0009]进一步地，所述植物骨干载体包含识别并引入突变的PegRNA表达框和用于Cas9蛋白表达和反转录酶表达的PE蛋白复合体。
[0010]关于骨干载体需要说明的是，其长度为17562，由于系统原因，超过1万bp的序列无法上传，申请人在序列表中将其拆分成了9000bp的序列表2和8562bp的序列表3，但是为了表述方便，下述的骨干载体序列均指代的是将序列表中的序列表2和序列表3顺序连接所形成的17562bp的骨干载体。
[0011]进一步地，所述PegRNA表达框包含35S
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CMYL
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U6复合型启动子，SpR抗性基因，HDV
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PolyT核酶+终止子，所述PegRNA表达框位于序列表骨干载体序列的第6263
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8901位，所述壮观霉素抗性基因SpR用于替换为靶向目的DNA片段的sgRNA、sgRNA骨架序列、逆转录模板RT和引物结合位点PBS、8bp linker序列。
[0012]进一步地，所述融合蛋白表达框包括ZmUBI启动子、经改造后的Cas9切刻酶或其变体编码序列、逆转录酶M
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MLV RT编码序列和35s终止子，所述表达框位于序列表骨干载体序列的第9008
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17279位
[0013]另一方面，本专利技术提供一种利用权所述的骨干载体构建靶向载体的方法，所述方法包括：
[0014]按照目的基因的编码序列和突变类型，选择sgRNA序列，得到相应的逆转录模板RT和引物结合位点PBS序列，用BsaI内切酶切开权利要求3所述的骨干载体，利用含BsaI的Golden Gate反应，将sgRNA序列、sgRNA骨架序列、RT和PBS序列、8bp linker序列替换壮观霉素抗性基因，形成用于作物目的基因的引导编辑重组载体。
[0015]另一方面，本专利技术提供一种所述表达框、所述载体的应用，所述应用包括将所述表达框或所述重组载体转入植物细胞，使细胞同时含有针对靶标基因的pegRNA和融合蛋白；并对生物体的基因组进行编辑，获得生物突变体，所述基因组序列的编辑为基因组序列的碱基替换、缺失和插入。。
[0016]Rab17启动子序列受干旱特异诱导，当干旱处理时，诱导下游基因高效表达，诱导表达的基因为Cre重组酶，通过识别同向的loxP识别位点并切割loxP之间的序列，同样包含3At终止子序列。
[0017]优选地，一种用于切除基因抑制表达框切除的重组酶特异识别位点包含方向一致的重组酶特异识别位点LoxP，分别位于序列表1的1
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34位和5879
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5912位。可以供Cre重组酶特异识别并高效切割。
[0018]此外该骨干载体包含识别并引入突变的PegRNA表达框和用于Cas9蛋白表达和反转录酶表达的PE蛋白复合体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于骨干载体的RNAi表达框的表达框，其特征在于，所述用于骨干载体的RNAi表达框包含启动子、MLH1基因互补序列、Nos终止子序列，其中，所述启动子序列如序列表中SEQ ID No.1的第59
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2048位所示，所述MLH1基因互补序列如序列表中SEQ ID No.1序列表1的2058
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2788位所示，所述Nos终止子序列如序列表中SEQ ID No.1的2902
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3154位所示。2.一种用于切除权利要求1所述表达框的重组酶表达框，其特征在于，所述重组酶表达框包含干旱诱导的Rab17启动子、Cre重组酶和3At终止子序列，干旱诱导的所述Rab17启动子如序列表中SEQ ID No.1的第3160
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4137位所示，Cre重组酶如序列表中SEQ ID No.1的第4140
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5365位所示，3At终止子如序列表中SEQ ID No.1的第5380
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5849位所示。3.根据权利要求2所述的重组酶表达框，其特征在于，所述重组酶表达框的特异识别位点包含方向一致的重组酶特异识别位点LoxP，二者分别位于序列表1的1
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34位和5879
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5912位。4.一种植物骨干载体，其特征在于，所述植物骨干载体包括权利要求1所述的用于骨干载体的RNAi表达框和权利要求2所述的重组酶表达框。5.根据权利要求4所述的植物骨干载体，其特征在于，所述植物骨干载体包含识别并引入突变的PegRNA表达框和用于Cas9蛋白表达和反转录酶表达的PE蛋白复合体。6.根据权利要求5所述的植物骨干载体，其特征在于，所述PegRNA表达框包含35S

【专利技术属性】
技术研发人员：许蓉芳，李娟，秦瑞英，王士梅，谷东方，卞士权，章潇，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院水稻研究所，
类型：发明
国别省市：