西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系的荧光定量内参基因及其引物制造技术

本发明专利技术公开了西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系的荧光定量内参基因及其引物。本发明专利技术从多个候选内参基因中筛选出DnaJ基因，在ECM真菌定殖不同时期根系(采用无菌互作体系接种彩色豆马勃0、1、2、7d时的西南桦组培苗根尖)和西南桦不同组织(组培苗根、组培苗茎、组培苗叶、嫁接苗茎尖、嫁接苗幼茎、嫁接苗雄花序)中的表达稳定性强。即DnaJ基因在西南桦ECM真菌定殖不同时期根系以及不同组织中表达稳定，能够作为西南桦外生菌根形成过程及不同组织荧光定量PCR的内参基因。本发明专利技术还提供了DnaJ基因的qRT

【技术实现步骤摘要】
西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系的荧光定量内参基因及其引物


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系的荧光定量内参基因及其引物。

技术介绍

[0002]西南桦(Betula alnoides Buch.
‑
Ham.ex D.Don)是我国热带、南亚热带地区的速生乡土珍贵树种。其木材材质优良、用途广泛，尤其是西南桦家具、木地板等深受市场青睐；树皮可入药，用于治疗眼疾、感冒、风湿和消化道疾病等。近20年来，西南桦人工林发展迅速，已成为该地区造林面积最大的乡土阔叶树种之一。由于其重要的经济价值和研究价值，西南桦的分子生物学研究逐渐受到重视。
[0003]利用实时荧光定量PCR(qRT
‑
PCR)分析基因表达水平是现代分子生物学研究中的重要手段，因其定量准确、特异性强、灵敏度高及高通量的优点被广泛应用于基因表达分析。在qRT
‑
PCR中，对目标基因相对表达量的分析主要通过内参基因的均一化来确定，因此，选择合适的内参基因非常关键。理想的内参基因应该在各种环境条件下、在不同的组织和细胞中都能恒定或相对稳定地表达。常用的内参基因有肌动蛋白家族(ACTIN)、核糖体蛋白基因(Ribosomal protein L,RPL)、转录延伸因子基因(Elongation factors 1alpha,EF
‑
1α)、多聚泛素酶基因(ubiquitin,UBQ)、甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde
‑3‑
phosphate dehydrogenase,GAPDH)、β微管蛋白基因(tubulin,TUB)等。但这些广泛应用的内参基因在不同植物品种及不同实验条件下表达的稳定性差异很大，甚至可能截然相反，盲目地使用一种内参基因会影响试验结果的准确性。因此，选择何种内参基因对于定量PCR结果是否准确显得尤为重要。迄今为止，关于西南桦内参基因特别是在外生菌根(ECM)形成过程中内参基因的筛选几乎没有报道。因此，筛选出稳定的内参基因对西南桦基因表达分析乃至西南桦分子生物学研究至关重要。

技术实现思路

[0004]本专利技术之目的在于，提供西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系的荧光定量内参基因及其引物。
[0005]本专利技术根据前期的转录组测序数据，应用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和Delta CT四个分析软件对包括泛素接合酶基因(UBC1和UBC2)、转录延伸因子基因(EF
‑
1α)、DEAD
‑
box RNA解旋酶基因(DDX)、甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶基因(GAPDH)、分子伴侣蛋白基因(DnaJ)、40S核糖体蛋白基因(40S RP)、肌动蛋白基因(ACT)和亲环蛋白基因(CYP)在内的九个候选内参基因在西南桦不同组织(组培苗根、组培苗茎、组培苗叶、嫁接苗茎尖、嫁接苗幼茎、嫁接苗雄花序)和ECM真菌定殖不同时期西南桦根系(采用无菌互作体系接种彩色豆马勃0、1、2、7d时的西南桦组培苗根尖)中的表达稳定性进行了分析。结果表明DnaJ基因在西南桦不同组织及ECM真菌定殖不同时期根系中稳定表达，即DnaJ基因能够作为qRT
‑
PCR的内
参基因对目标基因的表达水平进行归一化，解决了西南桦不同组织基因及参与ECM共生体形成基因的表达分析方面缺乏合适内参基因的问题。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供DnaJ基因作为西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系的荧光定量内参基因的应用，所述的DnaJ基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]DnaJ基因在西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系中具有良好的稳定性，为准确定量分析西南桦功能基因转录表达水平奠定基础。
[0008]本专利技术的第二个目的是提供DnaJ基因的特异性引物对，作为西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系的荧光定量引物的应用，所述的DnaJ基因的特异性引物对包括上游引物和下游引物，上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQ ID NO.3所示。
[0009]优选，所述的应用是采用荧光定量PCR，每个20μL的反应体系中含有：10μL 2
×
FastReal qPCR PreMix，0.5nmol/L上游引物0.6μL，0.5nmol/L下游引物0.6μL，100ng cDNA，加ddH2O至20μL；荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性5s，60℃退火10s，72℃延伸15s，40个循环。
[0010]优选，所述的不同组织是组培苗根、组培苗茎、组培苗叶、嫁接苗茎尖、嫁接苗幼茎和嫁接苗雄花序；所述的ECM真菌定殖不同时期根系是接种彩色豆马勃0、1、2、7d时的西南桦组培苗根尖。
[0011]本专利技术取得的有益效果：
[0012]本专利技术提供的内参基因DnaJ来源于西南桦的转录组数据，与传统的同源比对方法获得的内参基因相比，通过转录组数据筛选到的内参基因具有高量表达和稳定表达的特性。
[0013]本专利技术还提供了DnaJ基因的特异性引物对，应用于西南桦不同组织及外生菌根共生体形成过程中基因转录表达水平的qRT
‑
PCR检测，能够用于西南桦发育及共生体形成过程中关键基因的表达分析，能显著提高所得数据的精准性。本专利技术还提供了DnaJ基因的qRT
‑
PCR引物对，所述引物对扩增产物特异性强，扩增效率高。
附图说明
[0014]图1为西南桦9个候选内参基因的熔解曲线；
[0015]图2为西南桦各候选内参基因引物在进行qRT
‑
PCR时的标准曲线；
[0016]图3为西南桦候选内参基因在所有样品中qRT
‑
PCR的Ct值。
具体实施方式
[0017]以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。
[0018]实施例1：候选内参基因的筛选
[0019]1.西南桦候选内参基因的筛选
[0020]从转录组测序数据中选出表达量较高且表达一致的9个基因序列作为候选内参基因(表1)。
[0021]表1候选内参基因信息
[0022][0023][0024]2.西南桦不同组织的取样及总RNA提取
[0025]实验所用西南桦各样品采集于2022年，分别取组培苗根、组培苗茎、组培苗叶、嫁接苗茎尖、嫁接苗幼茎、嫁接苗雄花序以及采用无菌互作体系接种彩色豆马勃0、1、2、7d时的西南桦组培苗根尖。用清水仔细洗净根尖并用滤纸吸干水分后立即用液氮冷冻并保存于
‑
80℃冰箱内。
[0026]取100mg上述西南桦不同样品，在液氮中迅速研磨成粉末，使用植物RNA提取试剂盒(天根)提取西南桦不同组织的RNA。取3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.DnaJ基因作为西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系的实时荧光定量PCR内参基因的应用，其特征在于，所述的DnaJ基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述的DnaJ基因的特异性引物对作为西南桦不同组织和ECM真菌定殖不同时期根系的实时荧光定量PCR引物的应用，其特征在于，所述的DnaJ基因的特异性引物对包括上游引物和下游引物，上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQ ID NO.3所示。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用是采用实时荧光定量PCR，每个20μL的反应体系中含有：...

【专利技术属性】
技术研发人员：王欢，郭俊杰，王春胜，尹海锋，曾杰，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院热带林业研究所，
类型：发明
国别省市：