【技术实现步骤摘要】
增强胞内分子检测灵敏度的人工核糖核酸工具的构建方法
[0001]本专利技术属于合成生物学与生物
,特别涉及核酸工程中的增强胞内分子检测灵敏度的人工核糖核酸工具的构建方法。
技术介绍
[0002]人工核糖核酸工具(synthetic RNA tools)在药学发现、疾病诊断和细胞重编程等领域中具有革命性的应用,其原理为模拟自然界中的基因调控,感应特定的细胞内分子作为输入,调节输出蛋白质的产生,从而对目标细胞进行靶向调控,其中有一类人工核糖核酸工具可以作为对胞内分子的检测。例如,Saito及其合作者开发了合成核糖核酸分子开关(Synthetic RNA switches),可检测模型蛋白(model proteins)与胞内微小核糖核酸(microRNAs)。这些人工核糖核酸工具调控输出蛋白的功能基于对胞内分子的有效感应,其灵敏度是保证工具对目标细胞靶向性调控的关键,因此有必要进一步提高其灵敏度和增强检测的信号。
技术实现思路
[0003]本专利技术的目的是提供一种有效增强胞内分子检测灵敏度的增强胞内分子检测灵敏度的人工核糖核酸工具的构建方法。本专利技术的另一目的是提供一种人工核糖核酸工具对自身表达量形成正反馈,从而放大其报告蛋白因感应胞内分子造成的信号改变,提高细胞内分子检测灵敏度的增强胞内分子检测灵敏度的人工核糖核酸工具的构建方法。
[0004]本专利技术的技术解决方案是所述增强胞内分子检测灵敏度的人工核糖核酸工具的构建方法,其特殊之处在于,在转染入目标细胞后,在感应序列感应胞内分子的同 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】 【专利技术属性】
1.一种增强胞内分子检测灵敏度的人工核糖核酸工具的构建方法,其特征在于,在转染入目标细胞后,在感应序列感应胞内分子的同时,通过正反馈的表达调控放大报告蛋白的表达信号,从而提高胞内分子检测的灵敏度;所述构建方法,包括以下步骤:
⑴
构建人工核糖核酸工具的输出蛋白的开放阅读框序列;
⑵
使用低表达量/弱5
′
端帽(five
‑
prime cap)控制输出蛋白的基础表达量;
⑶
构建该人工核糖核酸工具的非翻译区(untranslated regions)序列;其5
′
非翻译区(five prime untranslated region)中有适配体(aptamer),可与开放阅读框表达的融合蛋白中核糖核酸结合蛋白域特异性结合;所述5
′
非翻译区或3
′
非翻译区中有分子感应序列(sensing sequence),可特异性感应胞内分子,影响开放阅读框编码的输出蛋白的表达量。2.根据权利要求1所述增强胞内分子检测灵敏度的人工核糖核酸工具的构建方法,其特征在于,步骤
⑴
所述的开放阅读框序列,进一步包括:开放阅读框表达融合蛋白(fusion protein),所述融合蛋白含有报告蛋白域(reporter protein domain)、核糖核酸结合蛋白域(RNA binding protein domain)和VPg蛋白域(viral protein genome
‑
linked domain)。3.根据权利要求1或2所述增强胞内分子检测灵敏度的人工核糖核酸工具的构建方法,其特征在于,所述步骤
⑴
进一步包括:(1.1)报告蛋白域:报告蛋白域为可被检测的报告蛋白的序列;(1.2)核糖核酸结合蛋白域为完整的模型核糖核酸结合蛋白序列,与所述人工核糖核酸工具分子通过非共价键的相互作用特异性结合;所述核糖核酸结合蛋白为外源蛋白,不与胞内原有蛋白组重叠;核糖核酸结合蛋白域与报告蛋白域的C端相接,根据融合蛋白的蛋白结构需求,决定是否采用连接序列相接;(1.3)VPg蛋白域:VPg蛋白域用于与胞内翻译起动因子(translation initiation factors)结合启动翻译;VPg蛋白域直接与核糖核酸结合蛋白域的C端相接。4.根据权利要求1所述增强胞内分子检测灵敏度的人工核糖核酸工具的构建方法,其特征在于,所述步骤
技术研发人员:旷怡,梁正桦,谭开鑫,
申请(专利权)人:香港科技大学深圳研究院,
类型:发明
国别省市:
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