一种从中国白酒发酵酒醅中同时快速提取总DNA和总RNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种从中国白酒发酵酒醅中同时快速提取总DNA和总RNA的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术针对白酒酒醅样品的特殊性，通过联合月桂酸钠(SodiumLaurate，SL)抽提法以及酚

【技术实现步骤摘要】
一种从中国白酒发酵酒醅中同时快速提取总DNA和总RNA的方法


[0001]本专利技术涉及一种从中国白酒发酵酒醅中同时快速提取总DNA和总RNA的方法，属于生物


技术介绍

[0002]白酒酿造体系中的微生物种类最为复杂多样，微生物物种的多样性正是白酒风味多元化的密码。然而，目前人们对白酒酿造微生物及何种微生物如何产生何种风味物质的认识，仍然处在初级阶段。
[0003]近年来，通过扩增子技术和宏转录组学的方法，从DNA和mRNA水平上研究环境微生物，取得了很大的成功，且获得的结果更准确、可靠。随着对群落微生物的结构和功能研究的深入，需要提取某一种生态体系内全部微生物的总DNA和总RNA作为分析群落微生物结构和功能的基本要求。
[0004]由于发酵酒醅理化成分复杂，常含有糖多酚及微生物的次级代谢产物，酒醅样品处理和实验条件复杂，耗时长，导致从酒醅中获得微生物基因组及转录组具有较大的难度，DNA和RNA提取技术创新因此备受关注。目前有的关于群落微生物的总DNA和总RNA提取方法，在不同的样本中存在很大的不同，其中主要包括直接提取法和间接提取法。而无论是直接提取法还是间接提取法，对发酵的酒醅样品的适用性并不强。因此，开发一种简便的、适合快速提取群落微生物的总DNA和总RNA的方法，尤其是适合白酒发酵过程的群落微生物的总DNA和总RNA提取方法，是非常有必要的。

技术实现思路

[0005]基于上述问题，本专利技术的目的是在于提供了一种从中国白酒发酵酒醅中快速提取总DNA和总RNA的方法，通过联合月桂酸钠(Sodium Laurate，SL)抽提法以及苯酚
‑
氯仿
‑
异戊醇抽提法，能在2小时内分别、快速提取群落微生物的总DNA和总RNA。利用本专利技术的方法提取的微生物总DNA和总RNA产量高、完整性好、纯度较好，能有效提取样品中的真核和原核微生物。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种从中国白酒发酵酒醅中快速提取总DNA和/或总RNA的方法，所述方法具体步骤如下：
[0007](1)利用缓冲液将酒醅样品悬浮并加入玻璃珠漩涡震荡；
[0008](2)过滤收集滤液，高速离心，利用缓冲液重复洗涤沉淀3～5次，收集上清；
[0009](3)将步骤(2)得到的上清，高速离心，取沉淀，冷冻；
[0010](4)将抽提混合液加入新的离心管中，放置冰上；
[0011](5)将步骤(2)的冷冻的样品置于预冷的研钵中，倒入液氮，迅速研磨至粉末，期间不断加入液氮，防止研磨过程中RNA被降解；
[0012](6)将研磨好的粉末移入步骤(4)中装有抽提混合液的离心管中，并加入0.8
‑
1.5
倍体积的月桂酸钠抽提液，反复缓慢的摇匀，涡旋震荡；
[0013](7)高速离心，吸取上清液置于新的离心管中；
[0014](8)向步骤(7)的上清中加入0.8
‑
1.2倍体积的氯仿，盖好管盖，轻轻混匀，放置冰上；
[0015](9)高速离心，吸取上清液置于新离心管中；
[0016](10)向步骤(9)的上清中加入0.5
‑
1倍体积的异丙醇，混匀，冰上放置；
[0017](11)高速离心，弃去上清液；
[0018](12)加入体积浓度为70
‑
75％的乙醇洗涤沉淀，高速离心后弃去上清液；
[0019](13)加入ddH2O，即得到溶解的DNA/RNA。
[0020]在本专利技术的一种实施方式，步骤(1)中，所述缓冲液包括PBS缓冲液。
[0021]在本专利技术的一种实施方式，所述PBS缓冲液浓度为0.1mol/L，pH 7.3(121℃灭菌20min)。
[0022]在本专利技术的一种实施方式，所述步骤(1)中样品与缓冲液按照质量体积比(1:3)～(1:5)的比例混合，震荡时间为2
‑
3min。
[0023]在本专利技术的一种实施方式，所述离心管为Dnase
‑
free/Rnase
‑
free离心管。
[0024]在本专利技术的一种实施方式，步骤(4)中，所述抽提混合液包括25:24:1提取液，或将苯酚，氯仿，异戊醇试剂按照25:24:1体积比混合得到的。
[0025]在本专利技术的一种实施方式，步骤(6)中，所述粉末与抽提混合液按照质量体积比(1:5)
‑
(1:12)添加。
[0026]在本专利技术的一种实施方式，当抽提DNA时，抽提混合液的pH为7～9；当抽提RNA时候，抽提混合液的pH为4～6。
[0027]在本专利技术的一种实施方式，步骤(6)中，所述月桂酸钠抽提缓冲液：Tris
‑
HCl 0.1mol/L，NaCl 0.1mol/L，EDTA0.02 mol/L，月桂酸钠10g/L。
[0028]在本专利技术的一种实施方式，当抽提DNA时，月桂酸钠抽提缓冲液的pH为7～9；当抽提RNA时候，月桂酸钠抽提缓冲液的pH为4～6。
[0029]在本专利技术的一种实施方式，所述高速离心为10000～13000rpm。
[0030]在本专利技术的一种实施方式，步骤(3)、(7)、(9)、(11)中，所述离心的时间为10
‑
15min；步骤(12)中，所述离心的时间为5
‑
10min。
[0031]在本专利技术的一种实施方式，所述步骤(6)中涡旋震荡2min，反复缓慢摇匀10
‑
20min。
[0032]在本专利技术的一种实施方式，步骤(7)、(9)、(11)、(12)的离心是在0
‑
4℃的条件下进行的。
[0033]在本专利技术的一种实施方式，步骤(12)加入的乙醇体积为1mL。
[0034]在本专利技术的一种实施方式，步骤(13)是先室温倒置5min，再加入30
‑
50μLDNase
‑
Free/RNase
‑
Free ddH2O。
[0035]在本专利技术的一种实施方式，所述方法具体是：
[0036](1)取25g样品溶于100ml无菌0.1mol/LPBS(pH 7.3)缓冲液悬浮，加入5颗5
‑
6mm玻璃珠，漩涡震荡2
‑
3min；
[0037](2)4层纱布过滤，收集滤液，高速离心，沉淀用PBS缓冲液重复洗涤3～5次，收集上
清；
[0038](3)将步骤(2)收集的上清，11000rpm离心15min，弃上清，盖好管盖，液氮冷冻；
[0039](4)将抽提混合液加入无菌无酶的离心管中，放置冰上；
[0040](5)研钵以液氮预冷，将步骤(2)冷冻的样品置于研钵中，倒入液氮，迅速研磨至粉末，期间不断加入液氮，防止研磨过程中RNA被降解；
[0041](6)将研磨好的粉本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从中国白酒发酵酒醅中快速提取总DNA和/或总RNA的方法，其特征在于，所述方法具体步骤如下：(1)利用缓冲液将酒醅样品悬浮并加入玻璃珠漩涡震荡；(2)过滤收集滤液，高速离心，利用缓冲液重复洗涤沉淀3～5次，收集上清；(3)将步骤(2)得到的上清，高速离心，取沉淀，冷冻；(4)将抽提混合液加入新的离心管中，放置冰上；当抽提DNA时，抽提混合液的pH为7～9；当抽提RNA时候，抽提混合液的pH为4～6；(5)将步骤(2)的冷冻的样品置于预冷的研钵中，倒入液氮，迅速研磨至粉末，期间不断加入液氮；(6)将研磨好的粉末移入步骤(4)中装有抽提混合液的离心管中，并加入0.8
‑
1.5倍体积的月桂酸钠抽提液，反复缓慢的摇匀，涡旋震荡；当抽提DNA时，月桂酸钠抽提缓冲液的pH为7～9；当抽提RNA时候，月桂酸钠抽提缓冲液的pH为4～6；(7)高速离心，吸取上清液置于新的离心管中；(8)向步骤(7)的上清中加入0.8
‑
1.2倍体积的氯仿，盖好管盖，轻轻混匀，放置冰上；(9)高速离心，吸取上清液置于新离心管中；(10)向步骤(9)的上清中加入0.5
‑
1倍体积的异丙醇，混匀，冰上放置；(11)高速离心，弃去上清液；(12)加入体积浓度为70
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75％的乙醇洗涤沉淀，高速离心后弃去上清液；(13)加入ddH2O，即得到溶解的DNA/RNA。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，样品与缓冲液按照质量体积比(1:3)～(1:5)的比例混合，震荡时间为2
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3min。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述缓冲液包括PBS缓冲液。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心管为Dnase
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free/Rnase
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free离心管。5.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张红霞，杜海，徐岩，谭煜炜，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：