一种甜叶菊组织培养方法技术

本申请涉及甜叶菊培养的技术领域，具体公开了一种甜叶菊组织培养方法。该方法包括以下步骤：I、获取甜叶菊不定芽；II、多倍体诱导；III、生根培养；IV、炼苗和移栽，得到甜叶菊植株；多倍体诱导的方法包括以下步骤：以含有氧化剂的氰基丙烯酸酯溶液浸泡所述甜叶菊不定芽，以还原剂溶液洗涤，水洗；所述氰基丙烯酸酯溶液中氰基丙烯酸酯含量为10

【技术实现步骤摘要】
一种甜叶菊组织培养方法


[0001]本申请涉及甜叶菊培养的
，更具体地说，它涉及一种甜叶菊组织培养方法。

技术介绍

[0002]甜叶菊在食品和制药等领域发挥着非常重要的作用，其主要原因在于甜叶菊中富含活性成分，例如糖苷和黄酮。其中的甜菊糖苷甜度约为蔗糖的200
‑
300倍，但是热量仅仅是蔗糖的1/300。
[0003]目前针对甜叶菊的组织培养，包括多倍体诱变育种的步骤，诱变育种得到的甜叶菊中甜菊糖苷含量、植株抗逆性以及生长性等显著提高。人工诱导多倍体的方法有：物理诱变、化学诱变和生物诱变。其中化学诱变方法因其诱变方向稳定、效率高的优势被广泛使用。
[0004]目前常用的化学诱变剂为秋水仙素，其主要通过破坏细胞有丝分裂实现多倍体诱变育种。但是以秋水仙素作为诱变剂时存在植株死亡率高且试剂昂贵的不足；例如以150mg/L的秋水仙素溶液浸泡甜叶菊不定芽7
‑
21天，其诱导率为13.3
‑
20.8％，但是不定芽死亡率高达39.6
‑
77.8％。还有相关研究是以二硝基苯胺类除草剂(例如氟乐灵、氨磺灵)为诱变剂进行甜叶菊的多倍体诱变育种，其能降低甜叶菊植株在诱变育种后的死亡率，并保证一定的诱导率；例如以50mg/L的氟乐灵溶液浸泡甜叶菊不定芽12
‑
48h，其诱导率为15.7
‑
28.1％，死亡率降低至27.8
‑
56.2％。
[0005]但是尽管如此，多倍体诱变育种后不定芽死亡率还是较高，因此提供一种甜叶菊诱变育种的方法以进一步降低多倍体诱变育种时不定芽死亡率是必要的。

技术实现思路

[0006]为了进一步降低多倍体诱变育种时不定芽死亡率，本申请提供一种甜叶菊组织培养方法。
[0007]本申请提供的一种甜叶菊组织培养方法采用如下的技术方案：一种甜叶菊组织培养方法，包括以下步骤：I、获取甜叶菊不定芽；II、对所述甜叶菊不定芽进行多倍体诱导，得到存活的甜叶菊多倍体不定芽；III、对存活的所述甜叶菊多倍体不定芽进行生根培养，得到甜叶菊组培苗；IV、将所述甜叶菊组培苗进行炼苗和移栽，得到甜叶菊植株；步骤II中多倍体诱导的方法包括以下步骤：以氧化剂溶液浸泡，以氰基丙烯酸酯溶液浸泡所述甜叶菊不定芽，以还原剂溶液洗涤，水洗；所述氰基丙烯酸酯溶液中氰基丙烯酸酯含量为10
‑
15mg/L。
[0008]相关技术中一般会添加较多剂量的处理剂处理不定芽，以保证较高的诱导率，但是该方式同样会带来较高的不定芽死亡率。本申请通过采用上述技术方案，主要以氰基丙
烯酸酯为诱变剂实现多倍体诱导。该方案中以较低剂量的氰基丙烯酸酯处理甜叶菊不定芽，以实现降低其死亡率的目的。但是仅仅以低剂量的氰基丙烯酸酯处理甜叶菊不定芽时，往往也会存在诱导率低的问题。因此以低剂量的氰基丙烯酸酯配合氧化剂来处理甜叶菊不定芽，以使得甜叶菊不定芽的死亡率低且诱导率提高。氧化剂可能会在一定程度上作用于细胞，使得细胞通透性增强，并进一步降低有丝分裂相关蛋白和酶的活性，以提高多倍体诱导的效果，提高诱导率；但同时和氰基丙烯酸酯的细胞损伤相比，氧化剂的细胞损伤相对较低，因此降低了甜叶菊不定芽死亡率。在以该方法处理甜叶菊不定芽后，进一步以还原剂洗涤，以避免残存的氧化剂和氰基丙烯酸酯持续损伤细胞。该方法是一种条件相对温和的化学诱导多倍体的方法，其能够同时兼顾多倍体诱导率和不定芽成活率。
[0009]可选的，氰基丙烯酸酯选自α
‑
氰基丙烯酸甲酯、α
‑
氰基丙烯酸乙酯中的任意一种或多种。
[0010]可选的，所述氧化剂溶液中氧化剂的含量为0.8
‑
1.2wt％。
[0011]通过采用上述技术方案，以适当量的氧化剂协作实现多倍体诱导。氧化剂含量过高同样会带来较大的细胞损伤，使得甜叶菊不定芽死亡率显著增高；而氧化剂用量过少时，将直接影响诱导率。
[0012]可选的，步骤II中以氰基丙烯酸酯溶液浸泡所述甜叶菊不定芽的时间为24
‑
48h。
[0013]可选的，所述氧化剂选自双氧水和臭氧中的任意一种或多种。
[0014]通过采用上述技术方案，以上几种氧化剂以适当用量处理甜叶菊不定芽时，对细胞损伤相对较小且不引入过多其他杂质，尤其是金属杂质。
[0015]可选的，所述氧化剂为双氧水。
[0016]通过采用上述技术方案，实验发现，以双氧水为氧化剂时，甜叶菊不定芽的多倍体诱导率和成活率均较优。
[0017]可选的，所述还原剂溶液中还原剂含量为1.5
‑
3wt％。
[0018]可选的，所述还原剂选自虾青素、茶多酚、单宁中的任意一种或多种。
[0019]可选的，获取甜叶菊不定芽的方法包括以下步骤：自甜叶菊植株上获取带腋芽茎段和/或顶芽部分，消毒灭菌处理后切割为0.5
‑
1.5cm大小，吸干水分后置于不定芽培养基上培养至组培苗高度为3
‑
4cm；去除组培苗叶片后的剩余部分切割为0.8
‑
1.2cm的茎段，置于不定芽培养基上培养，选择长度为0.3
‑
0.8cm的甜叶菊不定芽用于多倍体诱导。
[0020]可选的，所述不定芽培养基的组分包括：MS培养基、0.3
‑
0.8mg/L 6
‑
BA以及0.15
‑
0.75mg/L NAA。
[0021]可选的，步骤III中生根培养的方法包括以下步骤：将存活的所述甜叶菊多倍体不定芽置于生根培养基上培养至甜叶菊组培苗根长为5
‑
7cm。
[0022]进一步可选的，生根培养的培养条件包括：温度为24
‑
26℃，湿度为65
‑
75％，光照强度为1500
‑
2000μmol/(m2·
s)，光照时间为10
‑
14h/d。
[0023]可选的，生根培养基组分为：MS培养基、0.2
‑
0.5mg/L IBA以及0.1
‑
0.5mg/L NAA。
[0024]综上所述，本申请具有以下有益效果：1、本申请以低浓度的诱变剂结合氧化剂来处理甜叶菊不定芽，以实现降不定芽死亡率并保证不定芽诱导率的目的；该方案中，特殊选择用氰基丙烯酸酯为多倍体诱变剂，和其他诱变剂相比，和氧化剂协作后，其具有优异的提高诱导率和降低死亡率的效果。
[0025]2、本申请的氰基丙烯酸酯溶液中氰基丙烯酸酯含量为10
‑
15mg/L，氧化剂溶液中氧化剂的含量为0.8
‑
1.2wt％，以达到更优的降低不定芽死亡率和提高不定芽诱导率的目的。
[0026]3、本申请的方法，是以氧化剂先处理不定芽，再以诱变剂处理不定芽，最后以还原剂中和氧化剂以消除氧化剂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甜叶菊组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：I、获取甜叶菊不定芽；II、对所述甜叶菊不定芽进行多倍体诱导，得到存活的甜叶菊多倍体不定芽；III、对存活的所述甜叶菊多倍体不定芽进行生根培养，得到甜叶菊组培苗；IV、将所述甜叶菊组培苗进行炼苗和移栽，得到甜叶菊植株；步骤II中多倍体诱导的方法包括以下步骤：以氧化剂溶液浸泡，以氰基丙烯酸酯溶液浸泡所述甜叶菊不定芽，以还原剂溶液洗涤，水洗；所述氰基丙烯酸酯溶液中氰基丙烯酸酯含量为10
‑
15mg/L。2.根据权利要求1所述的一种甜叶菊组织培养方法，其特征在于，所述氧化剂溶液中氧化剂的含量为0.8
‑
1.2wt%。3.根据权利要求1所述的一种甜叶菊组织培养方法，其特征在于，步骤II中以氰基丙烯酸酯溶液浸泡所述甜叶菊不定芽的时间为24
‑
48h。4.根据权利要求1所述的一种甜叶菊组织培养方法，其特征在于，所述氧化剂选自双氧水和臭氧中的任意一种或多种。5.根据权利要求1所述的一种甜叶菊组织培养方法，其特征在于，所述氧化剂为双氧水。6.根据权利要求1所述的一种甜叶菊组织培养方法，其特征在于，所述还原剂溶液中还原剂含量为1.5
‑
3wt%。7.根据权利要求6所述的一种甜叶...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛奎静，方晓霞，江姗，王清华，孙永灿，闫莉，
申请(专利权)人：浙江觅得优生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：