一种改良的橙黄玉凤花种子萌发培养及小苗组培快繁方法技术

本发明专利技术提供一种改良的橙黄玉凤花种子萌发培养及小苗组培快繁方法，包括以下步骤：种子消毒处理、种子萌发培养基制备、愈伤组织增殖培养基制备、诱导茎叶分化培养基制备、叶生长培养基制备、球茎培养基制备、炼苗、移栽，本发明专利技术通过组织培养大量繁殖橙黄玉凤花，可实现满足市场需求与保护其野生资源的目的，在实验操作更加安全简便，降低了生产成本，组培苗成活率更高且更加强壮，具有极大的经济价值和社会价值。会价值。会价值。

【技术实现步骤摘要】
一种改良的橙黄玉凤花种子萌发培养及小苗组培快繁方法


[0001]本专利技术涉及橙黄玉凤花培养
，具体涉及了一种改良的橙黄玉凤花种子萌发培养及小苗组培快繁方法。

技术介绍

[0002]兰科植物玉凤兰属中，橙黄玉凤花Habenaria rhodocheila有着蝴蝶兰般的摇曳多姿，有红、橙、黄、粉等颜色，在泰国已有批量出口到世界各地。在我国，天然分布于江西、福建、湖南、广东、香港、海南、广西、贵州(榕江)。濒危野生动植物种国际贸易公约CITES中，橙黄玉凤花是附录Ⅱ里控制贸易的物种，在我国亦是二级保护植物。橙黄玉凤花的块茎，可用于清热解毒，活血止痛。主治肺热咳嗽，疮疡肿毒，跌打损伤。而在目前的文献资料中，相关栽培的报导仅有一篇，利用橙黄玉凤花种子萌发培养培育种苗，在其方法中，种子处理用升汞消毒，而在生产中升汞有剧毒，使用必须严格遵守操作规范，有风险。本专利技术采用次氯酸钠消毒，在生产中使用更加安全可控。文献中在原球茎增殖分化的培养基中加入ZT(玉米素)，该激素属于高温易分解失效的激素，不仅价格昂贵，而且必需在常温抽滤灭菌后加入到已经过高温灭菌后冷却到60℃的培养基中。操作繁琐，而且容易造成污染。因此，有待进一步的改进。

技术实现思路

[0003]本专利技术针对上述现有技术的不足而提供一种成本低、安全简便、能有效减少培养基污染的橙黄玉凤花种子萌发培养及小苗组培快繁方法。
[0004]本专利技术为解决上述问题所采用的技术方案为：
[0005]本专利技术提供一种改良的橙黄玉凤花种子萌发培养及小苗组培快繁方法，包括以下步骤：
[0006]步骤1：种子消毒处理
[0007]将采集的橙黄玉凤花蒴果，先用75％乙醇浸泡30s；再用10％次氯酸钠溶液分别浸泡15min、20min、25min，然后用无菌水冲洗5～6次，用无菌滤纸吸干表面水分；
[0008]步骤2：种子萌发培养基制备
[0009]种子萌发培养基以1/2MS为基本培养基，添加活性炭浓度分别为0、0.1％、0.2％，NAA浓度分别定为0、0.1、0.2uM 3个处理，并添加蔗糖3％和琼脂0.8％，pH 5.8～5.9。
[0010]步骤3：愈伤组织增殖培养基制备
[0011]愈伤组织增殖培养基以1/2MS为基本液体培养基，NAA浓度分别为0、0.1、0.2uM，添加活性炭浓度分别为0、0.1％、0.2％。
[0012]步骤4：诱导茎叶分化培养基制备
[0013]诱导茎叶分化培养基以1/2MS为基本培养基，6
‑
BA和NAA一起加入培养基，6
‑
BA浓度分别为0、0.01、0.1、0.5uM；NAA浓度分别为0、0.01、0.1、0.5uM，添加活性炭浓度分别为0、0.1％，添加蔗糖3％和琼脂0.8％，pH5.8～5.9。
[0014]步骤5：叶生长培养基制备
[0015]叶生长培养基以1/2MS为基本培养基，6
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BA浓度分别为0、0.01、0.02uM；GA3浓度分别为0、0.01、0.1、1.0uM，并添加蔗糖3％和琼脂0.8％，pH 5.8～5.9。
[0016]步骤6：球茎培养基制备
[0017]球茎培养基以1/2MS为基本培养基，添加不同浓度香蕉汁，每处理接种8个苗，培养基经高温高压灭菌后冷却备用，并添加蔗糖3％和琼脂0.8％，pH 5.8～5.9，30天后观察根部。
[0018]步骤7：炼苗、移栽
[0019]炼苗与移栽将长有球茎和2片小叶的瓶苗在室温条件下炼苗7d，拧松培养瓶盖再在室温条件下炼苗7d，打开培养瓶盖在室温阴凉条件下炼苗7d。取出小苗，将根茎清洗干净后，在阴凉处晾1d，栽种至基质中。移栽苗于温室大棚培养，60d后统计移栽苗成活率。移栽苗部分用于回归野外原生境。
[0020]进一步地，步骤1中每处理大约100个种子均匀地播种在培养基表面，30d后统计污染情况。
[0021]进一步地，步骤2中种子萌发实验中，每处理大约100个种子均匀地播种在培养基表面，每天观察萌发情况。种子开始萌发后，每20d统计其萌发株数，至60天后，萌发数量稳定为止。每处理3个重复。培养室温度在25
±
2℃，光照时间为16h，黑暗时间8h。光质为冷光荧光灯提供的40uE m
‑
2s
‑
1光照(以下实验培养条件相同)。
[0022]进一步地，步骤3中每个三角瓶装30ml培养液，每瓶培养液中接种20个种子萌发还未组织分化的胚，称重记录，置于90rpm转速的摇床中培养，20d后称取带培养液和胚的重量，每处理3个重复，通过三次平均值比较愈伤组织增殖重量的差异。
[0023]进一步地，步骤4中每个培养基中接种8个愈伤组织，每处理3个重复，40天后观察产生茎叶的数量和长度。
[0024]进一步地，步骤5中每个培养基中接种8个愈伤分化组织，每处理接3个重复，30天后观察叶片长度。
[0025]进一步地，步骤7中所述基质包括泥炭土。
[0026]进一步地，步骤6中香蕉汁浓度分别为0、50、100、0.10uM。
[0027]本专利技术的有益效果在于：
[0028]本专利技术所提供的一种改良的橙黄玉凤花种子萌发培养及小苗组培快繁方法主要有以下优点：
[0029](1)本专利技术通过组织培养，大量繁殖橙黄玉凤花，可实现满足市场需求与保护其野生资源的目的，同时本专利技术对原有的无菌播种诱导实生苗的组织培养方法进行了改良。在实验操作更加安全简便，降低了生产成本，组培苗成活率更高且更加强壮。
[0030](2)在外殖体消毒方面，采用了更加安全方便的次氯酸钠溶液消毒，减少了使用升汞的风险。
[0031](3)在愈伤组织增殖培养基上，本专利技术采用了使用用价廉能高温灭菌的6
‑
BA替代ZT，降低了生产成本，减少了培养基的配置步骤和污染风险。
[0032](4)在组培苗生产过程中，本专利技术增加了诱导茎、叶伸长和球茎生成的培养基和培育过程，培育的组培苗较原实验更加强壮。
[0033](5)本专利技术与原实验结论一致的是，种子萌发培养基中必须添加活性炭种子才能萌发。但是活性炭AC浓度应由原0.2mg
·
L
‑
1降至0.1mg mg
·
L
‑
1，萌发率可以从原先的80％提升至92％。
[0034](6)本专利技术发现除了在种子萌发过程中必须添加活性炭以外，在愈伤组织增殖、分化、根茎生成等步骤的培养基不需要添加活性炭。
[0035](7)本专利技术将原实验中生根环节减去，改为球茎培养。因为橙黄玉凤花原本根系是依附在球茎上细小但是浓密的根毛，在实验过程中，这些根毛在各个环节过程中就不断产生，不需要另增加生根步骤。但是培育强壮球茎，能提高组培苗品质。具有极大的经济价值和社会价值。
附图说明
[0036]图1是本专利技术一种改良的橙本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种改良的橙黄玉凤花种子萌发培养及小苗组培快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：种子消毒处理将采集的橙黄玉凤花蒴果，先用75％乙醇浸泡30s；再用10％次氯酸钠溶液分别浸泡15min、20min、25min，然后用无菌水冲洗5～6次，用无菌滤纸吸干表面水分；步骤2：种子萌发培养基制备种子萌发培养基以1/2MS为基本培养基，添加活性炭浓度分别为0、0.1％、0.2％，NAA浓度分别定为0、0.1、0.2uM 3个处理，并添加蔗糖3％和琼脂0.8％，pH 5.8～5.9。步骤3：愈伤组织增殖培养基制备愈伤组织增殖培养基以1/2MS为基本液体培养基，NAA浓度分别为0、0.1、0.2uM，添加活性炭浓度分别为0、0.1％、0.2％。步骤4：诱导茎叶分化培养基制备诱导茎叶分化培养基以1/2MS为基本培养基，6
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BA和NAA一起加入培养基，6
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BA浓度分别为0、0.01、0.1、0.5uM；NAA浓度分别为0、0.01、0.1、0.5uM，添加活性炭浓度分别为0、0.1％，添加蔗糖3％和琼脂0.8％，pH5.8～5.9。步骤5：叶生长培养基制备叶生长培养基以1/2MS为基本培养基，6
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BA浓度分别为0、0.01、0.02uM；GA3浓度分别为0、0.01、0.1、1.0uM，并添加蔗糖3％和琼脂0.8％，pH 5.8～5.9。步骤6：球茎培养基制备球茎培养基以1/2MS为基本培养基，添加不同浓度香蕉汁，每处理接种8个苗，培养基经高温高压灭菌后冷却备用，并添加蔗糖3％和琼脂0.8％，pH 5.8～5.9，30天后观察根部。步骤7：炼苗、移栽炼苗与移栽将长有球茎和2片小叶的瓶苗在室温条件下炼苗7d，拧松培养瓶盖再在室温条件下炼苗7d，打开培养瓶盖在室温阴凉条件下炼苗7d。取出小苗，将根茎清洗干净后，在阴凉处晾1d，栽种至基质中。移栽苗...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑洲翔，刘德浩，陈兆贵，吴新泉，
申请(专利权)人：泉州市洛江绿盛农业综合开发有限公司，
类型：发明
国别省市：