一种抗人CD47蛋白的抗体、核酸分子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗人CD47蛋白的抗体、核酸分子及其应用，涉及CD47抗体制备技术领域。提供的抗人CD47蛋白的抗体具有与天然抗原(CD47)蛋白较高的亲和力，为鼠源性单克隆抗体，能特异性识别人类细胞系MD

【技术实现步骤摘要】
一种抗人CD47蛋白的抗体、核酸分子及其应用


[0001]本专利技术涉及CD47抗体制备
，具体而言，涉及一种抗人CD47蛋白的抗体、核酸分子及其应用。

技术介绍

[0002]肿瘤是全球第二大导致人类死亡的病因。无论在发达国家还是在发展中国家，肿瘤导致的癌症都是死亡率最高的疾病，并且其死亡率和发病率仍不断增高。全球癌症疾病报告显示：过去十年里，全球癌症发病率升高了33％。仅2015年，就有1520万人被诊断为癌症，并有880万人因此死亡；发展中国家的癌症死亡率高于发达国家，患病人数占到全球的57％，死亡人数高达全球的65％，因此抗肿瘤药物市场的潜力十分巨大。
[0003]几乎所有肿瘤细胞都具有通过提高自身CD47蛋白表达，不但使其周围多种免疫细胞正常免疫杀伤功能受到抑制，而且表现出促进肿瘤组织扩增和转移的特性，这种特性能够导致患者病情进一步恶化。相关研究表明，阻断肿瘤细胞CD47相关的信号通路，能够解除肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用，从而激活肿瘤微环境中免疫细胞，尤其是巨噬细胞的杀伤功能，杀伤肿瘤细胞；活化的巨噬细胞通过吞噬靶细胞，发挥其抗原提呈的功能，特异性的活化T细胞，通过活化的T细胞发挥的细胞毒作用，进一步杀伤肿瘤细胞。
[0004]利用抗体结合细胞表面蛋白靶点治疗多种肿瘤和类风湿等免疫疾病已取得显著的效果；截至目前，经FDA批准上市的相关药物已超过60种。相关研究已经证明，利用抗CD47单克隆抗体，在体内特异性结合肿瘤细胞表面高表达的CD47蛋白，能够有效解除肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用，重新恢复机体免疫细胞功能，达到抑制肿瘤生长的效果。
[0005]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种新的抗人CD47的抗体，为肿瘤治疗提供更多的抗体选择。该抗体能特异性识别人类分化抗原47(CD47)，能够作为免疫活化物刺激机体的免疫反应，能够抑制肿瘤细胞的增殖，有可能产生抗肿瘤等疾病的效果。通过进行人源化表达抗体，可以用于靶向治疗。在低浓度时，红细胞完全不凝集。
[0007]本专利技术是这样实现的：
[0008]第一方面，本专利技术提供了一种抗人CD47蛋白的抗体或其抗原结合片段，其包括重链互补决定区和轻链互补决定区：
[0009]重链互补决定区包括氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1
‑
3所示的CDR
‑
H1、CDR
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H2和CDR
‑
H3；
[0010]轻链互补决定区包括氨基酸序列分别为SEQ ID NO.4
‑
6所示的CDR
‑
L1、CDR
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L2和CDR
‑
L3。
[0011][0012]本专利技术提供的抗人CD47蛋白的抗体具有与天然抗原(CD47)蛋白较高的亲和力，为鼠源性单克隆抗体，能特异性识别人类细胞系MD
‑
MB
‑
231(乳腺癌细胞)及Jurkat等细胞中表达的CD47蛋白。因此，可以用于开发以人CD47蛋白为诊断标志物的检测或诊断试剂、试剂盒。抗CD47的抗体一定浓度下不引起人红细胞凝集。可以用于进一步的人源化改造，从而靶向给药。此外，本专利技术提供的抗CD47的抗体对于Jurkat细胞(急性T细胞白血病细胞系)具有显著的抑制作用，并呈现一定的剂量和时间依赖性。因此，本专利技术提供的抗体能够有效抑制白血病细胞、乳腺癌细胞等肿瘤细胞的增殖，具有良好的肿瘤抑制活性。且抗体来源明确，成分确定，可重复性高，具有良好的应用前景。
[0013]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；重链可变区的结构为：FR1
‑
H
‑
CDR
‑
H1
‑
FR2
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H
‑
CDR
‑
H2
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FR3
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H2
‑
CDR
‑
H3
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FR4
‑
H4。
[0014]在一种可选的实施方式中，抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。轻链可变区的结构为：FR1
‑
L
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CDR
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L1
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FR2
‑
L
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CDR
‑
L2
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FR3
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L2
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CDR
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L3
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FR4
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L4。
[0015]人源化后的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；人源化后的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
[0016]SEQ ID NO.11：
[0017]VQLVQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWINWVRQAPG QGLEWIGRIVPGSGSTSYNEMFKRRVTMTVDTSTSTAYMELNSLR SEDTAVYYCARGELRREFAYWGQGTLVTVSS；
[0018]SEQ ID NO.12：
[0019]DIELTQSPASLSASPGERATITCRASSSVSSSYLHWYQQKPGQ APKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSVEPEDFATYYC QQYSGNHYTFGGGTKVEIK。
[0020]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述抗原结合片段选自抗体的Fab
’
、Fab、F(ab
’
)2、scFv和Fv中的任意一种；
[0021]在一种可选的实施方式中，抗体的恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区；
[0022]在一种可选的实施方式中，抗体的恒定区的种属来源为人、小鼠、大鼠、牛、马、羊、兔或狗。
[0023]上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本专利技术记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本专利技术公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
[0024]上述抗体的功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
[0025]将获得单克隆细胞株测序，获得抗人CD47单克隆抗体的可变区基因序列，利用可变区序列，通过改造进行人源化表达，利用毕赤酵母的得到人源化CD47<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗人CD47蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其包括重链互补决定区和轻链互补决定区：所述重链互补决定区包括氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1
‑
3所示的CDR
‑
H1、CDR
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H2和CDR
‑
H3；所述轻链互补决定区包括氨基酸序列分别为SEQ ID NO.4
‑
6所示的CDR
‑
L1、CDR
‑
L2和CDR
‑
L3。2.根据权利要求1所述的抗人CD47蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；优选地，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；优选地，所述抗原结合片段选自所述抗体的Fab
’
、Fab、F(ab
’
)2、scFv和Fv中的任意一种；优选地，所述抗体的恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区；优选地，所述抗体的恒定区的种属来源为人、小鼠、大鼠、牛、马、羊、兔或狗。3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；优选地，所述抗原结合片段选自所述抗体的Fab
’
、Fab、F(ab
’
)2、scFv和Fv中的任意一种；优选地，所述抗体的恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区；...

【专利技术属性】
技术研发人员：付康，严政，李胡丹，
申请(专利权)人：生工生物工程上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：