用于检测犬细小病毒试纸条及杂交瘤细胞、单克隆抗体和应用制造技术

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种用于检测犬细小病毒的荧光试纸条及杂交瘤细胞、单克隆抗体和应用。本发明专利技术的试纸条在结合垫内包被有荧光微球标记犬细小病毒单克隆抗体和荧光标记兔IgG；在硝酸纤维素膜表面上设置有检测线和质控线，在检测线内包被有犬细小病毒单克隆抗体，在质控线内包被有兔抗IgG；其中，犬细小病毒单克隆抗体为采用保藏号为C202355的杂交瘤细胞分泌得到。本发明专利技术的试纸条可用于同时检测猫细小病毒、犬细小病毒以及犬细小病毒的各基因型，具有较高的灵敏度和特异性，并且具有准确、快速且简便的技术优势。快速且简便的技术优势。

【技术实现步骤摘要】
用于检测犬细小病毒试纸条及杂交瘤细胞、单克隆抗体和应用


[0001]本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种用于检测犬细小病毒试纸条及杂交瘤细胞、单克隆抗体和应用。

技术介绍

[0002]犬细小病毒病毒病Canine parvovirus(CPV)是由犬细小病毒感染幼犬引起的一种急性、高传染性的病毒性疾病。CPV是一种小型、无包膜、单股负链DNA病毒，呈二十面体对称结构，基因组长度约为5kb，主要编码两个非结构蛋白(NS1和NS2)和两个结构蛋白(VP1、VP2和VP3)。其中VP2是主要的衣壳蛋白，占核衣壳总量的90％，也是主要的结构成分及免疫原性蛋白，能够促进机体产生中和性抗体。该病最早出现于1970年，我国于1982年首次报道该病，之后便逐渐蔓延到全球。该病的潜伏期大约为3～7天，临床上表现为严重的胃肠炎、呕吐、腹泻、发烧等症状，幼犬和纯种犬最为易感，同时病死率也相对较高，因此对中国乃至全世界的养犬业及宠物行业造成了严重的影响。因此早期的预防和检测对于该病的控制具有非常重要的现实意义。
[0003]常见犬细小病毒病的检测方法包括血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光检测技术(IFA)、聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增检测技术(LAMP)及免疫层析检测技术等。上述检测方法各有优缺点，相较于免疫层析检测技术，其余方法虽然反应相对灵敏，但整体操作较复杂、检测的时间较长、需要特定的仪器及专业的技术人员进行操作，因此不适用于现场的快速诊断。
[0004]免疫层析技术是近些年新发展起来的基于抗原抗体特异性反应的新型诊断检测技术，标记物主要为胶体金、量子点及时间分辨荧光微球等。目前对于CPV的检测主要是胶体金免疫层析检测方法，但该方法存在稳定性差、敏感性低等弊端，容易出现假阳性和假阴性等结果，不利于该病的早期检测和预防。
[0005]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种用于检测犬细小病毒的荧光试纸条及杂交瘤细胞、单克隆抗体和应用，本专利技术的试纸条可同时检测猫细小病毒、犬细小病毒及犬细小病毒各基因型。
[0007]本专利技术提供了一种用于检测犬细小病毒的荧光试纸条，包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；结合垫内包被有荧光微球标记犬细小病毒单克隆抗体和荧光标记兔IgG；硝酸纤维素膜表面上设置有检测线和质控线，检测线内包被有犬细小病毒单克隆抗体，质控线内包被有兔抗IgG；犬细小病毒单克隆抗体为采用保藏号为C202355的杂交瘤细胞分泌得到。
[0008]可选的，检测线内：犬细小病毒单克隆抗体的包被浓度为0.4～1.0mg/mL、优选为
0.6mg/mL，包被量为0.5～2μL/cm，优选为1μL/cm；质控线内：兔抗IgG的包被浓度为0.4～1.0mg/mL、优选为0.5mg/mL，包被量为0.5～2μL/cm，优选为1μL/cm。
[0009]可选的，结合垫内荧光微球标记犬细小病毒单克隆抗体的包被量为4～10μg，优选为6μg；优选的，荧光标记犬细小病毒单克隆抗体和兔抗IgG的质量比为1：1。
[0010]可选的，荧光微球和犬细小病毒单克隆抗体的质量比为1：20～40，优选为1：30；荧光微球和兔IgG的质量比为1：40～80，优选为1：50。
[0011]本专利技术还提出该荧光试纸条的制备方法，至少包括以下步骤：
[0012]S1、分别制备荧光微球标记犬细小病毒单克隆抗体和荧光微球标记兔IgG；
[0013]S2、分别对结合垫和样品垫进行封闭，结合垫上喷涂荧光微球标记犬细小病毒单克隆抗体和荧光微球标记兔IgG；
[0014]S3、硝酸纤维素膜表面上分别喷涂检测线和质控线；检测线内包被犬细小病毒单克隆抗体；质控线内包被兔抗IgG；
[0015]S4、将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组装，得到试纸条。
[0016]可选的，S1包括：活化荧光微球后，分别加入犬细小病毒单克隆抗体、兔IgG进行孵育，孵育后加入BSA溶液封闭；优选的，活化采用EDC和NHS溶液进行活化；优选的，孵育的时间为1～3小时，孵育的温度为20～25℃。
[0017]可选的，S2包括：采用样品垫封闭液对样品垫进行封闭，样品垫封闭液的组成为：0.75％Tween
‑
20、1％PEG20000、3％ BSA的硼酸溶液；采用结合垫封闭液对结合垫进行封闭，结合垫封闭液的组成为：3％海藻糖、2％BSA、0.75％Tween
‑
20、0.5％TritonX
‑
100的硼酸溶液；优选的，封闭的时间为1～3小时，温度为36～38℃。
[0018]本专利技术还提出一种分泌病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏号为CCTCC NO:C202355。
[0019]本专利技术还提出一种犬细小病毒单克隆抗体，采用保藏号为CCTCC NO:C202355的杂交瘤细胞分泌得到。
[0020]本专利技术还提出该犬细小病毒单克隆抗体在制备用于检测犬细小病毒的制剂、试剂盒或疫苗中的应用。
[0021]本专利技术实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
[0022]本专利技术的试纸条可用于同时检测猫细小病毒和犬细小病毒，具有较高的灵敏度和特异性，并且具有准确、快速且简便的技术优势。
[0023]本专利技术的犬细小病毒单克隆抗体具有特异性强、结合能力强的技术优势。
附图说明
[0024]图1为VP2重组蛋白的SDS
‑
PAGE实验结果；
[0025]图2为收集抗体纯化的洗脱液进行SDS
‑
PAGE的实验结果；
[0026]图3为6A8 mAb作为一抗与CPV进行Western
‑
blot的实验结果；
[0027]图4为间接免疫荧光试验(IFA)实验结果；
[0028]图5为血凝反应的结果图；
[0029]图6为T线6A8 mAb包被量比较的实验结果；
[0030]图7为结合垫内荧光微球标记6A8 mAb比较的实验结果；
[0031]图8为反应时间比较的实验结果；
[0032]图9为检测限的实验结果；
[0033]图10和图11为特异性的实验结果；
[0034]图12和图13为敏感性的实验结果；
[0035]图14为犬细小病毒的各基因型的特异性实验结果；
[0036]图15为稳定性的实验结果。
[0037]保藏信息
[0038]本专利技术杂交瘤细胞株 CPV VP2 6A8 Hybridoma cell line CPV VP2 6A8于2023年3月8日保藏于湖北省武汉市武昌区八一路299号的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C202355。
具体实施方式
[0039]为了本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测犬细小病毒的荧光试纸条，其特征在于，包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述结合垫内包被有荧光微球标记犬细小病毒单克隆抗体和荧光标记兔IgG；所述硝酸纤维素膜表面上设置有检测线和质控线，所述检测线内包被有犬细小病毒单克隆抗体，所述质控线内包被有兔抗IgG；所述犬细小病毒单克隆抗体为采用保藏号为CCTCC NO:C202355的杂交瘤细胞分泌得到。2.根据权利要求1所述的荧光试纸条，其特征在于，所述检测线内，所述犬细小病毒单克隆抗体的包被浓度为0.4～1.0mg/mL、优选为0.6mg/mL，包被量为0.5～2μL/cm，优选为1μL/cm；所述质控线内，所述兔抗IgG的包被浓度为0.4～1.0mg/mL、优选为0.5mg/mL，包被量为0.5～2μL/cm，优选为1μL/cm。3.根据权利要求1所述的荧光试纸条，其特征在于，所述结合垫内荧光微球标记犬细小病毒单克隆抗体的包被量为4～10μg，优选为6μg；优选的，荧光标记犬细小病毒单克隆抗体和兔抗IgG的质量比为1：1。4.根据权利要求1～3任一项所述的荧光试纸条，其特征在于，荧光微球和所述犬细小病毒单克隆抗体的质量比为1：20～40，优选为1：30；荧光微球和兔IgG的质量比为1：40～80，优选为1：50。5.如权利要求1～4任一项所述荧光试纸条的制备方法，其特征在于，至少包括以下步骤：S1、分别制备荧光微球标记犬细小病毒单克隆抗体和荧光微球标记兔IgG；S2、分别对结合垫和样...

【专利技术属性】
技术研发人员：白雪，郑海学，田宏，石正旺，张成琪，孙亚杰，胡博，李双双，刘佳佳，许丽文，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：