外泌体检测试剂及检测方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及外泌体检测试剂及检测方法。本发明专利技术，利用靶向外泌体的抗体捕获外泌体，再利用靶向外泌体的适配体识别外泌体，通过G4结构的DNA模拟酶催化和RCA两种方式放大外泌体浓度信息。最后通过G4

【技术实现步骤摘要】
外泌体检测试剂及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及外泌体检测试剂及检测方法。

技术介绍

[0002]外泌体(exosome)是通过细胞内多泡体融合到质膜和胞外分泌形成的，直径在30
‑
150nm左右，由脂质双分子层组成。外泌体具有典型的囊泡结构，能够运输细胞内外的蛋白质、核酸、酶等物质，可通过细胞或各种生物体液，包括血液、唾液、尿液等分离出来。所有细胞都会释放外泌体，但应激状态下的细胞会产生比正常细胞更多的外泌体，如缺氧状态下的肿瘤细胞。研究发现，肿瘤分泌的外泌体能够通过调节肿瘤微环境，从而促进癌症的形成。外泌体成为一种优异的癌症生物标志物，可以在一定程度上反映癌症的发展。因此，基于外泌体在指示癌症相关的生理状态等方面具有重要作用，外泌体越来越多的被应用于癌症的诊断、治疗和监测中(Biosensors and Bioelectronics,2021,183,113176；Methods in molecular biology 2022,2504,3
‑
20)。
[0003]目前已经开发了多种外泌体检测方法，包括纳米颗粒跟踪分析(NTA)、ELISA、Western Blot、质谱分析等(Proteomics,2017,17,1600370；Analytical Chemistry,2019,91,13297
‑
13305)。传统的ELISA和Western Blot等方法虽然可以定量外泌体表面丰富的蛋白，但它们的特异性较差，需要大量样本，成本高，稳定性差等缺点限制了它们在临床中的应用。相比之下，新兴的比色法、荧光光谱法、电化学检测、表面增强拉曼(SERS)和表面等离子体共振(SPR)等方法具有高灵敏度，但也容易受到其他信号干扰的影响。(Journal of Biomedical Nanotechnology,2022,18,1084
‑
1096；Nanoscale,2019,11,10106
‑
10113；Frontiers in Bioengineering and Biotechnology,2022,9,808933；ACS Sensors,2018,3,1471
‑
1479)因此，需要进一步优化这些新方法，以提高其特异性和准确性，从而更好地应用于临床实践中。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供外泌体检测试剂及检测方法。
[0005]外泌体的检测试剂，其包括：包被抗体的磁珠、适配体、G
‑
Padlock和显色试剂；
[0006]所述包被抗体的磁珠中，抗体为靶向外泌体的抗体；
[0007]所述适配体靶向外泌体表面蛋白质，且修饰有荧光基团；
[0008]所述G
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Padlock能够与所述适配体发生滚环扩增反应；
[0009]所述显色试剂包括紫外显色试剂和/或荧光显色液；
[0010]所述紫外显色液中包括Hemin和TMB，
[0011]所述荧光显色液中包括NMM。
[0012]G
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四链体(G
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quadruplex，G4)是一种由富含串联重复鸟嘌呤(G)的DNA或RNA折叠形成的高级结构。一些具有卟啉结构的小分子，如氯化血红素(Hemin)或N
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甲基卟啉二丙酸IX(NMM)等，通过π
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π作用在G4的末端堆叠。本专利技术提供的试剂，利用靶向外泌体的抗体捕获
外泌体，再利用靶向外泌体的适配体识别外泌体，通过G4结构的DNA模拟酶催化和滚环扩增(RCA)两种方式放大外泌体浓度信息。最后通过G4
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Hemin结构催化TMB氧化显色或形成G4
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NMM结构产生荧光信号，从而完成对外泌体的检测。
[0013]本专利技术中，所述抗体和适配体都靶向外泌体表面的蛋白质。根据采用的抗体和适配体的不同，本专利技术所述的试剂，可以对所有的外泌体进行检测，也可以对不同细胞来源的外泌体进行区分和检测。
[0014]所述外泌体表面的蛋白质包括但不限于：热休克蛋白8(HSPA8)、CD63抗原(CD63)、β肌动蛋白(ACTB)、甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶(GAPDH)、烯醇化酶1α(ENO1)、细胞溶质热休克蛋白90α(HSP90AA1)、CD9、CD81、酪氨酸3
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单加氧酶/色氨酸5
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单加氧酶激活蛋白、zeta多肽(YWHAZ)、肌肉丙酮酸激酶(PKM2)，作为优选，本专利技术所述试剂中，抗体靶向CD63、CD81或CD9。
[0015]其中，CD63是外泌体的检测标志物，利用靶向CD63的抗体和适配体能够实现对外泌体良好的检测和识别，从而实现对外泌体的定性检测。配合标准曲线法或者其他方法，也可以实现对外泌体的良好定量检测。根据检测得到的外泌体含量，依据不同组织来源的外泌体浓度的不同(例如，癌细胞来源的外泌体浓度较正常细胞来源的高)，可以实现对样本来源的判断。
[0016]为了区分不同来源或种类的外泌体，所述试剂中的抗体靶向CD63蛋白，而适配体靶向待测外泌体的特异性表达的标志物(例如，肿瘤细胞外泌体表面的特异性标志物蛋白)。从而实现对不同来源或种类外泌体的鉴别。
[0017]在一些实施例中，抗体靶向CD63蛋白，适配体也靶向CD63蛋白。
[0018]本专利技术中，所述磁珠也可以被其他微球载体替换，例如：可以为聚乙烯微球、乳胶微球、淀粉微球、明胶微球等。本专利技术中，所述抗体可以直接包被在磁珠上，也可以通过链霉亲和素
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生物素连接在磁珠上，本专利技术对此不做限定。为了提高抗体利用率简化制备工艺，本专利技术通过链霉亲和素
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生物素将抗体连接在磁珠上。
[0019]本专利技术中，所述适配体和所述G
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padlock都为单链DNA。其中，G
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padlock的5
’
端经磷酸化，能够与其3
’
端连接成环。适配体能够与G
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padlock发生部分杂交，形成双链结构。
[0020]本专利技术中，所述适配体的核酸序列为：CACCCCACCTCGCTCCCGTGAC ACTAATGCTA(SEQ ID NO:1)。相对于其他适配体，其能够更好的识别外泌体，实现更良好的检测效果。
[0021]本专利技术中，所述适配体的末端修饰有荧光基团，所述荧光基团选自FITC、FAM、Cy3、Cy5、BODIPY、罗丹明、AFC、AMC、Rox、Sulforhodamine 101、5
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TAMRA、EDANS Texas Red、5
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Tamra、5
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lodoacetamido fluorescein中任一种。一些实施例中，所述适配体的3<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.外泌体的检测试剂，其包括：包被抗体的磁珠、适配体、G
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Padlock，和显色试剂；所述包被抗体的磁珠中，抗体为靶向外泌体的抗体；所述适配体靶向外泌体表面蛋白质，且修饰有荧光基团；所述G
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Padlock能够与所述适配体发生滚环扩增反应；所述显色试剂包括紫外显色试剂和/或荧光显色液；所述紫外显色液中包括Hemin和TMB，所述荧光显色液中包括NMM。2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述包被抗体的磁珠中，所述抗体为CD63抗体，所述抗体与磁珠通过链霉亲和素
‑
生物素连接。3.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述适配体为靶向CD63的适配体，其核酸序列如SEQIDNO:1所示；所述荧光基团为FAM。4.根据权利要求1或3所述的检测试剂，其特征在于，所述G
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padlock具有如SEQIDNO:2所示的核酸序列。5.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述紫外显色液中Hemin的浓度为100～500nM，TMB的浓度为0.5～5mM；所述荧光显色液中，NMM的浓度为1～10μM。6.根据权利要求5所述的检测试剂，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李丹，孙旭，董青，汪尔康，汪劲，
申请(专利权)人：中国科学院长春应用化学研究所，
类型：发明
国别省市：