集成多价适配体和多功能纳米酶的致病菌侧流层析检测方法技术

本发明专利技术公开了集成多价适配体和多功能纳米酶的致病菌侧流层析检测方法，具体涉及使用多价适配体和多功能纳米复合材料开发试纸条检测方法和产品，进行致病菌的检测，属于生物检测领域。本发明专利技术通过构建基于HCR扩增的多价适配体，极大提高了适配体与靶标的亲和率，亲和率增加为常规适配体的8倍；借助和Fe3O4@MOF@PtPd纳米酶出色的过氧化物酶活性，使得试纸条检测致病菌的结合时间提高3倍，并且仅需要改变特殊的适配体即可用于检测其他致病菌，构建出用于快速、灵敏、低成本的的试纸条检测方法，该上述检测方法具有巨大的应用潜力。该上述检测方法具有巨大的应用潜力。该上述检测方法具有巨大的应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
集成多价适配体和多功能纳米酶的致病菌侧流层析检测方法


[0001]本专利技术涉及集成多价适配体和多功能纳米酶的致病菌侧流层析检测方法，具体涉及使用多价适配体和多功能纳米复合材料开发试纸条检测方法和产品，进行致病菌的检测，属于生物检测领域。

技术介绍

[0002]基于抗原
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抗体特异性识别的侧流免疫分析(LFIA)是致病菌即时检测最广泛应用的技术之一，具有简单、快速、可视化、无需复杂仪器等优点。然而，抗体的筛选过程复杂且耗时，并且存在批间差异大、存储要求高等不足。通过指数富集(SELEX)体外筛选的单链寡核苷酸配体——适配体，较抗体它具有更好的稳定性、更低的成本、更容易合成的优点。因此，基于适配体的侧流分析方法(Apt
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LFA),引起了研究者极大的兴趣。尽管适配体相关研究发展迅速，但由于结合亲和力不理想，适配体在致病菌的检测应用仍存在一定的局限性。
[0003]多价适配体(multi
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Apt)由多个适配体组成的系统，它可以与靶标上的一个以上的结合点或受体结合。与单体适配体(mono
‑
Apt)相比，multi
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Apt的协同作用，可以有效降低适配体和靶标结合的熵损失，从而使适配体具有更强的结合亲和力、更高的特异性、更高的稳定性。目前，已经开发了许多方法构建多价适配体，包括将无机纳米材料、聚合物纳米颗粒、脂质体和DNA纳米结构作为支架，将多种适配体组合成多价系统。在这些方法中，杂交链反应(HCR)是一种等温、无酶的核酸扩增策略，是构建DNA支架的一种方便有效的方法。
[0004]传统的胶体金纳米颗粒(Au NPs)目前已广泛用于LFA条带上的信号探针。然而，传统的LFA的检测灵敏度往往受到限制，难以满足食品中致病菌的检测要求。因此，采用适配体和新型纳米探针，开发具有更强识别能力和高灵敏度的致病菌LFA方法和试纸，具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0005][技术问题][0006]现有的适配体致病菌检测方法，存在适配体与致病菌亲和力较低的问题。常规胶体金LFA检测致病菌灵敏度较低，为满足食品监测的要求，常与一些核酸扩增信号放大方法相结合，使得检测耗时较长。上述不足严重限制了适配体侧向层析分析(LFA)试纸在致病菌检测的发展。
[0007][技术方案][0008]本专利技术所用的羧基功能化的Fe3O4纳米粒子是通过溶热反应合成。Fe3O4@MOF@PtPd,Fe3O4@MOF@Pt,Fe3O4@MOF@Pd这几种纳米粒子的制备首先分别制备了铂钯纳米粒子(PtPdNPs)、铂纳米粒子(PtNPs)和钯纳米粒子(PdNPs)溶液，在剧烈搅拌下滴加到2.0～3.0mL Fe3O4@MOF的N,N
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二甲基甲酰胺(DMF)中(10～12mg/mL)。混合后的溶液，再进行搅拌，磁场回收样品，洗涤，真空干燥等过程后使用。
[0009]本专利技术采用Fe3O4@MOF@PtPd@VAN\cDNAc作为探针，该探针是在牛血清白蛋白
(BSA)，1
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乙基
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(3
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二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N
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羟基琥珀酰亚胺(NHS)的作用下，将万古霉素和cDNAc修饰在Fe3O4@MOF@PtPd表面形成探针Fe3O4@MOF@PtPd@VAN\cDNAc，NC膜的测试线(T线)喷洒SA，对照线(C线)喷洒SA
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Bio
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DNAc，构建了通用型的致病菌检测方法。该检测方法在T线喷涂的SA，以及在C线喷涂的SA
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Bio
‑
DNAc无需改变，仅替换特定的适配体即可检测另一种革兰氏细菌，为以后的应用扩展提供了方便。
[0010]本专利技术是基于mHCR进行多价适配体(mHCR
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multi
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Apt)的构建，制备了两个亚稳态生物素化的发夹DNA(H1和H2)，其中，具有悬垂结构的H1通过linker与具有延伸链(Sa
‑
Bio
‑
exApt)的生物素化的mono
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Apt杂交，多支链DNA支架富含生物素，有利于与试纸条T线上链霉亲和素发生作用从而被有效的捕获。
[0011]本专利技术中，基于mHCR
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multi
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Apt和磁性纳米酶Fe3O4@MOF@PtPd的试纸条检测方法(MA
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MN LFA)由两部分组成，一个是目标的识别系统，主要通过探针Fe3O4@MOF@PtPd@VAN\cDNAc和多价适配体mHCR
‑
multi
‑
Apt对目标菌进行特异性识别与捕获，另一个是LFA信号输出系统，在目标菌存在的情况下，目标菌通过探针上的万古霉素(VAN)和mHCR
‑
multi
‑
Apt双识别形成三明治复合物，三明治复合物进一步通过mHCR
‑
multi
‑
Apt上的生物素被T线上的SA捕获，从而将探针Fe3O4@MOF@PtPd@VAN\cDNAc固定到T线上。在缺乏目标菌的情况下，探针仅在C线上被捕获。
[0012]本专利技术中Fe3O4@MOF@PtPd纳米复合材料的磁性是实现从复杂基质样品中分离致病菌的一个关键特性。Fe3O4@MOF@PtPd纳米复合材料具有较强的超顺磁性，可在在外部磁场下22秒内表现出快速反应，从而确保在复杂样品中对目标菌的磁分离。
[0013]本专利技术的快速检测特性体现在纳米复合材料探针对目标菌的响应速率上。适配体需与目标菌孵育通常需要60min及以上才能充分结合，从而达到较好的信号响应，而本专利技术中mHCR
‑
multi
‑
Apt仅需要15min即可达到甚至超过常规适配体孵育60min的效果。
[0014]本专利技术的第一个目的是提供了基于多支链HCR(mHCR)的多价适配体(mHCR
‑
multi
‑
Apt)，包括生物素化的适配体mono
‑
Apt、引发链和生物素化的发夹链H1、H2。
[0015]在一种实施方式中，制备所述多价适配体的方法为将引发链与发夹链按照浓度比1：20～1：5混合孵育后加入适配体反应一定时间得到的。
[0016]在一种实施方式中，30～37℃孵育1～2h，30～37℃反应0.5～1h。
[0017]在一种实施方式中，所述引发链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述发夹链H1和H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0018]在一种实施方式中，所述生物素化的适配体mono
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Apt由延伸链Sa
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Bio
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exApt和适配体Sa
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种MA
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MNLFA传感器，其特征在于，所述传感器包括多价适配体、信号探针Fe3O4@MOF@PtPd@VAN\cDNAc、显色试剂和链霉亲和素
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生物素
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DNAc；所述信号探针Fe3O4@MOF@PtPd@VAN\cDNAc由Fe3O4纳米颗粒为核、MIL
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100(Fe)和铂钯纳米立方PtPdNPs为壳层构成，并且在表面修饰了万古霉素和cDNAc；所述多价适配体包括生物素化的适配体、引发链和生物素化的发夹链H1、H2。2.根据权利要求1所述的MA
‑
MNLFA传感器，其特征在于，制备所述多价适配体的方法为将引发链与发夹链按照浓度比1：20～1：5混合30～37℃孵育1～2h后加入适配体30～37℃反应0.5～1h。3.根据权利要求1所述的MA
‑
MNLFA传感器，其特征在于，所述Fe3O4纳米颗粒的粒径为235
±
12nm，所述铂钯纳米立方的粒径为5～10nm。4.根据权利要求3所述的MA
‑
MNLFA传感器，其特征在于，所述引发链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述发夹链H1和H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述生物素化的适配体mono
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Apt的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述DNAc的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述cDNAc的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。5.根据权利要求1～4任一所述的MA
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MNLFA传感器，其特征在于，所述MA
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MNLFA传感器包括样品垫、金标垫、NC膜、吸收垫和PVC底板；所述PVC底板上依次黏贴样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫；所述NC膜的测试线和对照线上分别喷洒2～4mg/mL链霉亲和素和83～85μmol/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭池方，徐婷婷，王丽英，李秀萍，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：