树突状细胞靶向的类病毒体DVLP及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种树突状细胞靶向的类病毒体DVLP及其制备方法和应用。所述类病毒体DVLP由序列如SEQ ID NO.1所示的Sindbis病毒糖蛋白包裹VLP构成。其制备包括：优化野生型Sindbis病毒的囊膜蛋白氨基酸，得到SV

【技术实现步骤摘要】
树突状细胞靶向的类病毒体DVLP及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，涉及树突状细胞靶向的类病毒体DVLP及其制备方法和应用，具体涉及树突状细胞靶向的类病毒体mRNA递送技术在疫苗中的应用。

技术介绍

[0002]树突状细胞(DC)是一种重要的抗原呈递细胞(APCs)，对疫苗的效果起着十分重要的作用，其功能主要体现在以下两点：第一，DC细胞能够将抗原加工呈递至T细胞，从而诱导细胞免疫；第二，DC细胞能够将抗原加工呈递至B细胞并诱导体液免疫反应。2010年美国食品和药物管理局批准全球首个DC细胞疫苗PROVENGE用于治疗前列腺癌。然而，PROVENGE生产过程复杂、繁琐，涉及患者自体细胞分离、体外制备，而后进行体内回输。因此，该疫苗生产成本和销售价格高昂，普及性差。此外，抗原mRNA在非专职APC的翻译，可能使表达抗原的细胞成为CD8+T细胞介导杀伤的靶标。某些人群在接受COVID
‑
19mRNA疫苗后出现副作用有关与此有关。另外，抗体依赖性细胞毒性(ADCC)也有可能破坏那些存在抗原蛋白嵌入或分泌的宿主细胞。
[0003]因此，特异性靶向DC是下一代mRNA疫苗的发展方向，可以简化生产工艺、降低生产成本、提高疫苗安全性，同时增强疫苗的免疫效果。DC细胞ICAM
‑
3整合素(DC
‑
SIGN)是DC细胞的模式识别受体和粘附受体，在DC细胞迁移与粘附、炎症反应、激活T细胞、启动免疫反应等过程中发挥重要作用。以Sindbis病毒糖蛋白作为DC
‑
SIGN配体的重组慢病毒载体(LV)相较于非特异性LV而言，具有更好免疫效果的潜力。然而，整合插入突变等风险因素限制了LV疫苗的临床转化。尽管LNP可以通过与特异性抗体或配体偶联获得靶向DC细胞的特异性，但目前仍然缺少基于LNP的DC细胞靶向性mRNA疫苗的有效性证据。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种树突状细胞靶向的类病毒体DVL P及其制备方法和应用，该类病毒体(DVLP)源自对慢病毒载体(LV)的工程改造，能够携带mRNA特异性靶向DC细胞。
[0005]本专利技术的目的可通过以下技术方案来实现：
[0006]第一方面，本专利技术提供一种树突状细胞靶向的类病毒体DVLP，所述类病毒体DVLP包括病毒样颗粒(VLP)、Sindbis病毒糖蛋白，所述Sindbis病毒糖蛋白包裹于VLP表面，所述VLP内部包裹有mRNA。
[0007]作为本专利技术的一个实施方式，所述Sindbis病毒糖蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]作为本专利技术的一个实施方式，所述mRNA包括spike、病毒抗原、肿瘤抗原、细菌抗原的mRNA中的至少一种。
[0009]进一步的，所述mRNA由spike、病毒抗原、肿瘤抗原、细菌抗原的基因转录得到。
[0010]在一些实施例中，所述mRNA包括spike的mRNA、HSV
‑
1病毒的gB1和gD1 mRNA。
[0011]第二方面，本专利技术提供一种树突状细胞靶向的类病毒体DVLP的制备方法，包括以下步骤：
[0012]S1、对野生型Sindbis病毒的囊膜蛋白的氨基酸序列进行优化，得到SV
‑
G基因；
[0013]S2、构建SV
‑
G基因的表达载体，得到pCMV
‑
SV
‑
G质粒；
[0014]S3、将pCMV
‑
SV
‑
G、pRSV
‑
REV、抗原表达载体、pMDlg/PRRE
‑
D64V和pMS2S
‑
PH
‑
gag pol
‑
D64V质粒共同转染HEK293T细胞，转染后收取细胞培养上清并纯化。
[0015]作为本专利技术的一个实施方式，步骤S1中，SV
‑
G基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。SV
‑
G基因序列为编码Sindbis病毒糖蛋白的核苷酸序列。
[0016]本专利技术中，野生型Sindbis病毒的囊膜蛋白具有靶向DC细胞的倾向性，经过改造后，提高靶向DC细胞的能力，同时不影响病毒的滴度。
[0017]作为本专利技术的一个实施方式，步骤S2中构建SV
‑
G基因的表达载体包括以下步骤：
[0018]S2.1、在SV
‑
G序列上、下游整合同源臂，得到人工合成序列；
[0019]S2.2、将人工合成序列和pMD2.G质粒进行双酶切，纯化回收；
[0020]S2.3、使用T4 DNA连接酶将回收产物连接，形成质粒pCMV
‑
SV
‑
G。
[0021]作为本专利技术的一个实施方式，步骤S2.1中，所述人工合成序列如SEQ ID NO.3所示。
[0022]作为本专利技术的一个实施方式，步骤S2中，所述pCMV
‑
SV
‑
G质粒的核苷酸序列如SE Q ID NO.4所示。
[0023]作为本专利技术的一个实施方式，所述抗原表达载体为pCMV
‑
mRNA
‑
mut
‑6×
MS2。其中，mRNA选自spike、病毒抗原、肿瘤抗原、细菌抗原的mRNA中的至少一种。
[0024]在一些实施例中，所述抗原表达载体包括pCMV
‑
Spike
‑
mut
‑6×
MS2、pCMV
‑
gB1
‑
gD1
‑6×
MS2。
[0025]本专利技术中，pRSV
‑
REV、pCMV
‑
Spike
‑
mut
‑6×
MS2、pMDlg/PRRE
‑
D64V和pMS2S
‑
PH
‑
ga gpol
‑
D64V的构建方法参照专利CN112168958A；其中，pRSV
‑
REV的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；pCMV
‑
Spike
‑
mut
‑6×
MS2指代该专利中的pCMV
‑
nCoV
‑
S
‑
6XMS2
‑
mut
‑
flag，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；pMDlg/PRRE
‑
D64V指代该专利中的pMDlg/PRRE的整合酶缺陷型，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；pMS2S
‑
PH
‑
gagpol
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种树突状细胞靶向的类病毒体DVLP，其特征在于，所述类病毒体DVLP包括病毒样颗粒VLP、Sindbis病毒糖蛋白，所述Sindbis病毒糖蛋白包裹于VLP表面，所述VLP内部包裹有mRNA。2.根据权利要求1所述的类病毒体DVLP，其特征在于，所述Sindbis病毒糖蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的类病毒体DVLP，其特征在于，所述mRNA包括spike、病毒抗原、肿瘤抗原、细菌抗原的mRNA中的至少一种。4.一种如权利要求1
‑
3任一项所述类病毒体DVLP的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、对野生型Sindbis病毒的囊膜蛋白的氨基酸序列进行优化，得到SV
‑
G基因；S2、构建SV
‑
G基因的表达载体，得到pCMV
‑
SV
‑
G质粒；S3、将pCMV
‑
SV
‑
G、pRSV
‑
REV、抗原表达载体、pMDlg/PRRE
‑
D64V和pMS2S
‑
PH
‑
gag pol
‑
D64V质粒共同转染HEK293T细胞，转染后收取细胞培养上清并纯化。5.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡宇伽，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：