一种木本植物花药培养胚状体的方法技术

本发明专利技术提供了一种木本植物花药培养胚状体的方法，它是取木本植物花药内的花粉小孢子的发育处于单核晚期，在无菌条件下，接种于愈伤细胞诱导培养基，以分化形成胚状体。所述的木本植物是枇杷属植物。本发明专利技术方法加快枇杷育种进程，提高枇杷优良品种的选育效率。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种木本植物花药培养胚状体的方法，具体地说，是通过花药培养技术获得胚状体的方法。
技术介绍
申请号02158575.X专利技术名称为“一种花药或花粉培养获得单倍体植株的方法”，公开了一种将花药直接接种于液体培养基中，进行花药漂浮培养。首先，该方法是针对所有植物的话，没有实用价值，因为对于花药花粉培养而言，植物种类不同，培养条件和培养方法决不相同，各种植物上得到的结果只对本植物有效。其次，它没有清楚说明是通过何种途径实现植株再分化。花药花粉培养实现植株再生的途径有两条，一是愈伤组织直接再分化形成芽；二是再分化形成胚状体，胚状体萌发成苗。最后，就花药花粉培养而言，获得的植株不一定就是单倍体，还存在一个筛选的过程。枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)为蔷薇科(Rosaceae)枇杷属(Eriobotrya)植物，别名卢橘，是我国亚热带地区的珍稀特产水果。果实的成熟期一般在4～6月，正值水果淡季，果实色泽美观、果肉鲜美可口，深受消费者的喜爱，市售价格较高；据刘国强等统计，我国枇杷约有14个种，600多个品种。目前，我国枇杷的品种选育途径有以下几种(1)实生选种。如由龙泉驿区林业局选育出的特晚熟枇杷新品种“红灯笼”；福建省果树研究所选育出的高产、早熟新品种“长红3号”；少核、可食率高的“太城4号”；江西科委选育出的抗寒优质品种“杨梅洲四号”；江苏吴县果树研究所选出的果大、质优的白沙枇杷“冠玉”等。(2)杂交育种。如由福建省农科院果树研究所以大果型“解放钟”为父本，“香甜”为母本杂交育成的“香钟11号”；以解放钟为母本，早熟日本枇杷“森尾早生”作父本杂交育成的“早钟6号”。(3)引种。我国从日本引进的枇杷品种有“瑞穗”、“茂木”、“森尾早生”、“田中”、“户越”等，最近又从西班牙引进一些新的品种，这些品种的引进丰富了我国枇杷的种质资源，为培育新的品种奠定了基础。(4)生物技术育种。由于枇杷童期长，常规育种难度大，通过生物技术育种可以加速育种进程。万志刚等对白沙枇杷“冠玉”的茎尖培养、孔素萍等对“大五星”枇杷的胚培养都加快了良种繁育速度；彭晓军、陈振光、林顺权等通过对枇杷胚乳的离体培养试验，获得了再生植株；林庆良、林顺权、陈发兴等进行的枇杷原生质体培养，为通过原生质体融合技术培育枇杷新品种奠定了基础；(5)其它育种途径。如黄金松等利用秋水仙素作为诱变剂获得了四倍体枇杷“闽三号”；李孙逵、郑少泉等用60Co-γ射线辐射源分别处理了枇杷种子和枝条，有利的变异主要是少核、高可溶性固形物、细肉质、丰产和短枝等类型，几率为0.48％，同时可提早结实。但是由于枇杷的特殊习性，属多年生木本果树，有较长的营养生长时期，少则数年，多则数十年，然后才能生殖繁衍，这就使得按常规杂交育种方法进行枇杷育种周期长，且效率低，需要一种新的育种方法改变目前的现状。
技术实现思路
本专利技术的技术方案是提供了一种木本植物花药培养胚状体的方法，本专利技术的另一技术方案是提供了采用该方法获得的木本植物的胚状体。本专利技术提供了一种木本植物花药培养胚状体的方法，它是取木本植物花药内的花粉小孢子的发育处于单核晚期，在无菌条件下，接种于愈伤细胞诱导培养基，以分化形成胚状体。进一步地，所述的木本植物是枇杷属植物。更进一步地，所述的木本植物是枇杷Eriobotrya japonica Lindl.。其中，所述的枇杷花药胚状体的制备方法包括如下步骤a、取处于单核早期到单核晚期小孢子的枇杷花蕾，低温处理，刮去表面绒毛，清洗、消毒灭菌；b、从a步骤中消毒灭菌后的花蕾中取出花药，在无菌条件下接种于愈伤组织诱导培养基，在23±1℃黑暗条件下诱导枇杷花药脱分化形成愈伤组织；c、取b步骤的愈伤组织，接种于胚状体诱导培养基，愈伤组织再分化，形成胚性愈伤组织；d、再按c步骤方式培养，胚性愈伤组织再分化形成本专利技术胚状体。其中，a步骤所述的低温处理为4℃黑暗条件下低温处理48小时。温度必须保持4℃恒定不变。其中，b步骤所述的愈伤组织诱导培养基为MS+7％蔗糖+0.5mg/L 2，4-D+2.0mg/LBA。其中，c步骤所述的胚状体诱导培养基为MS+3％蔗糖+0.05mg/L ZT+0.02mg/LIBA+0.02mg/L NAA。培养基原料及浓度的选择决定了分化的效果。其中，c步骤所述的培养基培养条件下为光照2000lux，16h/d，共4周。整个培养过程对培养条件要求严格一致，各参数不能出现波动，温度、光照和培养过程中光照和黑暗时间对花药愈伤组织的再分化产生极显著影响，最终导致愈伤组织失去再分化能力。枇杷花蕾的采集时间与预处理温度、时间和方法的不同，培养条件(愈伤组织诱导时间黑暗条件、温度23±1℃)、(诱导胚状体再分化时暗培养和光培养的时间比)、培养时间、培养基类型、激素种类和配比等。这些方面均是各种植物花药培养是的区别点，也是本专利技术方法的技术特征。本专利技术还提供了采用该方法获得的木本植物的胚状体。本专利技术还提供了采用该方法获得的枇杷花药的胚状体。本专利技术制备胚状体所采用的途径为采用细胞工程手段，诱导枇杷花药内小孢子脱分化形成愈伤组织，通过特定的基本培养基、植物激素的种类、浓度和配比及培养条件，实现愈伤组织的再分化，形成胚状体。本专利技术明确了花药培养获得胚状体，花药培养育种，是将花粉培育成单倍体植株，再经染色体自然或人工加倍得到纯合二倍体的一种育种法。这种染色体加倍产生的纯合二倍体，在遗传上非常稳定，不发生性状分离，因此，花培育种能极早稳定分离后代、缩短育种年限。由于单倍体选择的显性方差减少，加性方差成倍增加，所以，在同一选择周期中，单倍体选择效率要比二倍体高得多。同时，花培加倍后的纯合二倍体植株，可排除杂合体中显性因子掩盖隐性因子造成的干扰，提高选择的准确性和可靠性。由于花粉植株是由单倍体直接加倍形成的，故隐性性状得以纯合表现，而且花粉植株不论来源于F1或F2，其当代株系均表现丰富的多样性，如株高、生育期、育性及抗性等。这些性状相互交叉，组成了具有多种形态特征的花培株系，因此，花培育种既可充分利用植物的种质资源，又可获得性状的多样性。花药胚状体是育种(获得单倍体、纯合二倍体和多倍体枇杷种质资源)、组织学和细胞学研究(研究胚胎的发生和发育)、转基因研究与应用(生产转基因植物)、快速繁殖(生产优良种苗)、人工种子生产(遗传性状优良个体推广)等方面的优良材料和载体。采用生物技术辅助育种，可大大加快木本果树的育种速度和进程，对隐性基因而言，常规育种F2代中，隐性基因纯合的几率为(1/4)n，其中n为目的隐性基因的个数。通过花药培养获得单倍体，再对单倍体进行染色体加倍，即可完成一次选育。通过单倍体育种技术，可迅速获得基因纯合的个体，尤其是对隐性基因的利用，F2代隐性基因纯合个体的获得的几率为(1/2)n。节约数十年的时间。可大大加快枇杷育种工作的进程；提高枇杷优良品种的选育效率。本专利技术实现枇杷花药愈伤组织的再分化，得到胚状体，为枇杷遗传工程建立起良好的育种材料，大大加快枇杷育种进程，提高选育效率，节约大量人力物力，具有重大的理论和现实意义为生物技术的上游技术(转基因)奠定了良好的基础，为组织学和细胞学研究、快速繁殖(生产优良种苗)、人工种子生产(遗传性状优良个体推广)等方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种木本植物花药培养胚状体的方法，其特征在于：取木本植物花药内的花粉小孢子的发育处于单核晚期，在无菌条件，２３±１℃黑暗条件下接种于愈伤细胞诱导培养基，以分化形成胚状体。

【技术特征摘要】
1.一种木本植物花药培养胚状体的方法，其特征在于取木本植物花药内的花粉小孢子的发育处于单核晚期，在无菌条件，23±1℃黑暗条件下接种于愈伤细胞诱导培养基，以分化形成胚状体。2.根据权利要求1所述的木本植物花药培养胚状体的方法，其特征于所述的木本植物是枇杷属植物。3.根据权利要求2所述的木本植物花药培养胚状体的方法，其特征在于所述的木本植物是枇杷Eriobotrya japonica Lindl.。4.根据权利要求3所述的木本植物花药培养胚状体的方法，其特征在于它包括如下步骤a、取处于单核早期到单核晚期小孢子的枇杷花蕾，4℃黑暗条件下浸泡48小时，刮去表面绒毛，清洗、消毒灭菌；b、从a步骤中消毒灭菌后的花蕾中取出花药，在无菌条件下接种于愈伤组织诱导培养基，在23±1℃黑暗条件下诱导枇杷花药脱分化形成愈伤组织；c、取b步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永清，李俊强，吴荭，周兰英，邓群仙，陈红，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：51[中国|四川]