一种大车前的体外繁殖方法技术

本发明专利技术公开了大车前的一种体外繁殖方法。该方法包括以下步骤：１）以种子为外植体，将其接种于直接再生培养基上诱导不定芽；直接再生培养基是在ＭＳ基本培养基的基础上添加了噻二唑苯基脲和吲哚乙酸；２）将不定芽置于生根培养基上进行生根培养；生根培养基为ＭＳ基本培养基。本发明专利技术为筛选具有高生物量的大车前抗盐突变体和基因转化建立了高效的体外再生系统和实验平台体系，同时，可在保持高生物量产出的基础上筛选出有价值的细胞系，以获得能够大量积累有效药用成分的突变体及大车前的耐盐突变体；此外，还可在此基础上建立基因转化体系，把有利的农艺性状以及相关抗性基因转入大车前，从而提高大车前的品质和抗逆性。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物的体外繁殖方法，特别是涉及大车前的一种体外繁殖方法。
技术介绍
车前属(Plantago)植物全世界有190余种，多数分布于受人为干扰强烈的环境中，该属中的许多种类属于典型的杂草，是理论生态学、生理生态学和进化生物学研究的理想材料。该属植物的药用价值也较高，其中，车前(Plantago.asiatica)、大车前(Plantago.major)和平车前(Plantago.depressa)等历来被列为中药中的上品，全草及种子皆可入药。传统医学认为，车前子有利水通淋、清肝明目的功效，可用于治疗小便不利、水肿等病症(Ji DH(季大洪)，Xiao ZY(肖振宇).Study andapplication of chinese traditional medicine Plantain.The Journal ofPharmaceutical Practice(药学实践杂志)，2001，19(6)361-362)。目前，对车前属植物的现代药理学研究也在不断地深入进行当中。车前属中包括大约20种盐生植物，例如Plantago maritima L.能够耐受环境中250-300mM NaCl浓度；Plantago.coronopus L.能够在150mM NaCl环境中生存(Oscar V.，Monica B.，Miguel Angel N.，et al.Responses to salt stress in thehalophyte Plantago crassifolia(Plantaginaceae).Journal of AridEnvironments，2004，58463-481)，它们都可作为盐碱滩涂的先锋植物加以应用，对滩涂盐碱地的改造、防风固沙、水土保持、环境温度调节等方面具有积极作用，同时又是固碳、供氧和转化能量的良好材料的植物，但它们均存在生物量小的缺陷。与车前属其它种类植物相比，大车前(Plantago major L.)具有生物量大的特点，其园艺品种除可作为药用和观赏植物外，现正致力于将其开发为蔬菜品种。研究表明，大车前对盐分比较敏感在68.4mM(0.4％)NaCl浓度下，其生长便受到抑制，在111.2mM(0.65％)NaCl浓度下，相对生长量只达到正常生长条件下对照植株的一半。基于大车前具有上述优点，迫切需要一种大车前的体外培养和再生方法，以期获得能够大量积累有效药用成分的突变体及大车前的耐盐突变体。有关车前属植物的组织培养研究的报道较少，涂艺声(Tu YS(涂艺声).Cultivation of Plantago asiatica in vitro and plantlet regeneration..JiangxiScience(江西科学)，1995，13(3)149-152)和王秀芝(Wang XZ(王秀芝)，Wang L(王琳)，Hon XY(侯信营).Tissue culture and plantlet regeneration of Plantagoasiatica.Plant physiology Communications(植物生理学通讯)，1998，34(3)204)等分别用不同的外植体实现了国内常见野生种车前(Plantago asiatica L.)愈伤组织诱导及其植株再生；王秀芝等对平车前(Plantago depressa Willd.)的组织培养工作也有过报道(Wang XZ(王秀芝)，Zhang QP(张谦鹏)，Guo SL(郭善利).Tissueculture of Plantago depressa Willd.Jounal of Liaocheng Teachers College(Nat.Sci.)(聊城师院学报自然科学版)，1997，10(2)82-85)。Mederos等对大车前(Plantago major L.)的微繁(micropropagation)作了相关研究，取12mm长的顶芽在补充葡萄糖和0.5μM BAP(6-benzylaminopurine)的改良MS培养基上培养，25天后观察到芽的增殖，平均每个顶芽可得到7个增殖芽(Mederos S.，MartinC.，Navarro E.，et al.Micropropagation of a medicinal plant，Plantago majorL..Biologia Plantarum，1997/98；40(3)465-468)。但以顶芽为外植体，可取的材料不多，并受植物生长阶段的限制，迄今未得到培养细胞系。上述研究工作为大车前的组织培养方法的建立提供了参考，但同属不同种的植物尽管进化关系相近，但基因型不同，对组培条件的要求也相差甚远。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供大车前的培育周期较短、产率较高的一种体外繁殖方法。本专利技术所提供的大车前的体外繁殖方法，包括以下步骤1)以种子为外植体，将其接种于直接再生培养基上诱导不定芽；直接再生培养基是在MS基本培养基的基础上添加了噻二唑苯基脲(TDZ)和吲哚乙酸(IAA)；2)将不定芽置于生根培养基上进行生根培养；生根培养基为MS基本培养基。直接再生培养基中TDZ的浓度为0.5-4.0mg/L，优选为1.0mg/L；IAA的浓度为0.1-0.3mg/L，优选为0.2mg/L。所述培养条件为温度(25±1)℃，光照时间10-14h/天，光照强度2500-3500lux；优选的培养条件为温度(25±1)℃，光照时间12h/天，光照强度3000lux。所述不定芽的诱导时间为28-42天，优选为35天。本专利技术所提供的大车前(Plantago major L.″Giant Turkish.″)的体外培养方法，是以大车前种子作为外植体，通过诱导不定芽的产生、得到再生株系，从种子到再生株系只需要4-5周时间，平均每个外植体得到14.6个丛生芽，提高了培养效率，也为在植物组织水平进行相关研究提供了前提和保障。本专利技术为筛选具有高生物量的大车前抗盐突变体和基因转化建立了高效的体外再生系统和实验平台体系，同时，可在保持高生物量产出的基础上筛选出有价值的细胞系，以获得能够大量积累有效药用成分的突变体及大车前的耐盐突变体；此外，还可在此基础上建立基因转化体系，把有利的农艺性状以及相关抗性基因转入大车前，从而提高大车前的品质和抗逆性。附图说明图1为叶片外植体在培养基DRM-1上生长5周后不定芽的再生情况图2为种子外植体在培养基DRM-1上生长3周后不定芽的再生情况图3为种子外植体在培养基DRM-1上生长5周后不定芽的再生情况图4为在引物S252引导下的再生植株进行RADP分析的琼脂糖凝胶电泳检测结果图5为在引物S256引导下的再生植株进行RADP分析的琼脂糖凝胶电泳检测结果图6为在引物S405引导下的再生植株进行RADP分析的琼脂糖凝胶电泳检测结果具体实施方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、大车前的体外繁殖植物材料大车前的园艺品种(Plantago major L.″Giant Turkish.″)，种子购自Horizon Herbs公司(Oregon，USA)。一、不同浓度的TDZ对不定芽再生的影响将大车前的园本文档来自技高网...

【技术保护点】
大车前的一种体外繁殖方法，包括以下步骤：１）以种子为外植体，将其接种于直接再生培养基上诱导不定芽；直接再生培养基是在ＭＳ基本培养基的基础上添加了噻二唑苯基脲和吲哚乙酸；２）将不定芽置于生根培养基上进行生根培养；生根培养基为Ｍ Ｓ基本培养基。

【技术特征摘要】
1.大车前的一种体外繁殖方法，包括以下步骤1)以种子为外植体，将其接种于直接再生培养基上诱导不定芽；直接再生培养基是在MS基本培养基的基础上添加了噻二唑苯基脲和吲哚乙酸；2)将不定芽置于生根培养基上进行生根培养；生根培养基为MS基本培养基。2.根据权利要求1所述的繁殖方法，其特征在于所述直接再生培养基中噻二唑苯基脲的浓度为0.5-4.0mg/L，吲哚乙酸的浓度为0.1-0.3mg/L。3.根据权利要求2所述的繁殖方法，其特征在于所述直接再生培养基中噻二唑苯基脲的浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：李银心，李平，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]