本发明专利技术涉及一种用于透化微生物的壁的组合物和一种使用所述组合物计数和鉴定膜上细胞的方法，其中所述组合物包含辛基－β－Ｄ－吡喃葡萄糖苷（ＮＯＧ）、多聚磷酸钠（ＨＭＰ）和选自氯化铝或氯化铷的盐的组合。
【技术实现步骤摘要】
用于检测膜上活细胞的包含NOG、 HMP、氯化铷 和/或氯化锂的细胞透化组合物本专利技术涉及一种用于细胞透化的新型组合物，其包含N-辛基-P-D-吡喃 葡萄糖苷(NOG)、多聚磷酸钠(HMP)和选自氯化铷和氯化锂的盐的组合，该 组合物可籍荧光标记物标记细胞，同时保存所述细胞的活力。本专利技术还涉及一种检测和/或鉴定滤膜上液体或气体样品所含的活细胞 的方法。本专利技术特别适合于进入例如食品或药品生产链的液体和气体介质的微 生物质量控制。在该领域内，污染物可能以稀释在大量水或气体中的各种细胞形式存 在，尤其是革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。但仅检测这些细胞是不够的，还有必要对它们进行精确鉴定，确保它 们是介质中的活细胞，而不是在其使用前可能对空气或水进行处理所造成 的死细胞。例如，使用氯或臭氧进行水处理可导致介质中细胞死亡，这些 细胞可被肉眼检测到，不会成为污染源。现有技术中描述了许多检测方法，用于检测一定时间内滤膜上的液体 或气体介质中的活细胞的存在。这些方法一般包括-通过滤膜过滤所述液体或气体介质的步骤；-将与营养介质接触的所述膜与温育数小时的步骤，在此期间过滤后 仍存留在滤膜上的细胞发生分裂，形成肉眼不可见的微集落；以及-采用各种发光或荧光技术检测形成微集落的细胞克隆的步骤。例如WO 01/59157描述了这种方法。该方法己被用于开发检测活细胞的 通用试剂盒，名为"Milliflex Rapid" (Millipore)。在该方法中，检测细胞的步 骤由裂解滤膜上过滤后和温育后的细胞组成，裂解的目的在于释放细胞的 三磷酸腺苷(ATP)成分。释放的ATP被用作鉴定和定量活细胞(ATP-生物发 光)的标记物，它充当可产生化学发光反应的酶(荧光素酶)的底物。该化学 发光反应产生光信号，光信号被视频接口(CCD照相机)俘获，随后以合成图 像的形式储存。该合成图像可原位显现膜上微生物显影的地方，所采用的方式与在培养皿上的琼脂培养基中进行的常规计数类似。该技术具有可检测所有活细胞的优点，因为ATP是所有活生物体内大量 存在的分子。因此它能可靠地指示受试样品中存在的污染物数目。另一方面，提取ATP需要裂解，因此需要杀死细胞，无法随后培养微生 物进行鉴定，即确定微生物的种。因此关于污染所获得的信息只是定量而非定性。专利申请FR2289984描述了另一种检测膜上细胞的方法。在该方法中， 使用特异杂交探针检测存留在滤膜上的细胞。采用聚乙烯亚胺(PEI)和乙醇 的透化组合物，可使检测探针透过细胞壁， 一旦这些探针进入细胞，所述 探针与细胞内的基因组RNA或DNA序列发生特异杂交。这些探针一般为多 聚核苷酸，经选择可与核酸特异杂交，以耙向污染物的一个或多个种。洗 涤步骤后采用照相机检测标记有荧光剂或发光剂的探针，以定位滤膜上的 细胞。这种检测方法特异性虽然更高，但无法明确区分活细胞与死细胞。事 实上，探针在活细胞和死细胞内均发生杂交，因此会导致假阳性。此外， 即便透化组合物通常可保持细胞壁的完整性，但该方法的各个步骤却不能 保持细胞是活着的，尤其是由于将细胞固定在纤维素膜上的步骤。申请WO 2004/050902描述了另一种膜上检测的系统，它可检测污染血 液样品的微生物的存在。设计该方法旨在避免微生物的裂解。该系统的特 点在于过滤前使标记剂渗透进入微生物，进行微生物的检测，而此时微生 物仍处于液体介质中。就这点而言，在膜上进行过滤和检测细胞之前，使 用包含标记剂和透化剂的透化溶液稀释待测液体样品。使用的标记剂为小分子，尤其是DNA嵌入化合物，例如花菁衍生物、 碘化丙啶、吖啶橙或溴化乙锭。利用本领域技术人员知晓的透化剂例如聚 乙烯亚胺(PEI)、毛地黄皂苷、nonensin、多粘菌素或苯扎氯铵的作用，这些 化合物相对容易地渗透通过微生物的壁。所述嵌入剂在DNA转录或复制时 附着到核酸内部，即只发生在样品所含的活细胞中。该方法可标记所有活细胞，同时能保存细胞活力。但是，细胞在膜过 滤前在液体介质中被标记，这会引起最终得到的计数结果不可靠。事实上， 如果标记细胞时液相中的细胞正在分裂，膜上检测到的细胞数目可能是最 初存在细胞数目的两倍。而且，透化和标记组合物对液体样品的稀释会导致最终结果出现显著的误差容限，该误差容限随着成功检测所需的流体操 作引入的偶然污染的概率而增加。此外，在这种情况下，被标记细胞在膜上逐个过滤和检测，即一个细 胞接着一个细胞。结果是每个细胞的检测信号低。使用荧光标记物时更易出现这种问题。事实上，使用的膜一般由PVDF或纤维素组成，本身会产生 部分荧光，从而屏蔽来自细胞的微弱荧光信号。过去数年来已研制了所谓的"荧光"标记物。这些标记物具有事先被酶活 化时只在荧光区域发出荧光的特点。这些复合分子一般包含一个可吸收光 能并以特征性荧光发射光谱形式储存该能量的荧光基团，以及另一个可屏 蔽或阻止所述荧光基团的荧光显现其自身的基团。所述酶具有修饰第二基 团以使第一基团的荧光可被检测到的效应。这些荧光标记物特别适合于以细胞计量术计数活细胞，例如申请WO 98/55861所描述的细胞计数。但是，正如本专利技术指出，标记有荧光剂的细胞 的荧光信号通常过低，难以在膜上单独检测到，这与使用DNA嵌入荧光剂 所遇到的问题类似。申请WO 96/1443 l描述了一种检测微生物的技术，具体而言是检测大肠 菌，其依据是这些革兰氏阴性菌能够生成有可能活化荧光标记物的酶(3-葡萄糖醛酸酶和P-半乳糖苷酶。使用的相应荧光底物是甲基伞形酮-P-D-吡 喃半乳糖苷(MU-Gal)、 4-三甲基氟甲基-伞形酮-(5-D-P比喃半乳糖苷 (TFMU-gal)和4-三甲基氟甲基-伞形酮-(3-D-葡萄糖醛酸苷(TFMUG)。该技术 依据的原理与上述方法相同，其中首先过滤含有大肠菌的液体或气体样品， 随后在滤膜上温育细菌，再以上述荧光底物检测形成的微集落。但该技术具有某些局限性。第一个局限是该检测方法只适用于某些合成(3-葡萄糖醛酸酶和P-半乳 糖苷酶的革兰氏阴性菌(大肠菌)。第二个局限是细胞产生的(3-葡萄糖醛酸酶和13-半乳糖苷酶的量通常过 低，无法获得可检测的信号。因此，为了达到满意的敏感度，有必要使用 |3-葡萄糖醛酸酶和(3-半乳糖苷酶的合成表达诱导物，例如异丙基-P-硫代半 乳糖苷(IPTG)。另一局限涉及荧光标记物对细胞的渗透，检测到的信号强度直接取决 于此。由于标记物大小问题，且所述荧光标记物有被细胞经外排机制排出细胞的倾向，很难进行这种渗透。为了促进标记物渗透进入细胞，现有技术教导使用细胞透化剂例如抗生素多粘菌素B和粘菌素以及溶菌酶，并在40。C下温育细胞。虽然这种透化 方法可能足以对大肠菌有效，但对革兰氏阳性菌如寻找的致病菌金黄色葡 萄球菌是远远不满意的。此外，将抗生素剂例如多粘菌素B和粘菌素用作透 化剂不能保持细菌的活力。因此上述方法不仅只局限于检测大肠菌，也不能保持细胞是活着的。因此，现有技术方法不能满意地满足以下两个要求，即用于评价介质 中来自不同种的细胞数目的定量信息(检测所有活细胞)以及可鉴定存在的 所述种的定性信息。因此有必要有一种广谱透化组合物，即可透化许多各种类型的许多种 的细胞而不会对较脆弱的细胞有太大的攻击性。众所周知，本文档来自技高网...
【技术保护点】
细胞透化组合物，其可用于使荧光标记物渗透进入细胞同时保持所述细胞的活力，其特征在于所述组合物包含： ａ）终浓度（重量／体积）至少为０．０１％的Ｎ－辛基－β－Ｄ－吡喃葡萄糖苷（ＮＯＧ）； ｂ）终浓度（重量／体积）至少为０．１％的多 聚磷酸钠（ＨＭＰ）；以及 ｃ）终浓度（摩尔每升）至少为１ｍｍｏｌ．１↑［－１］的氯化铷和／或氯化锂。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：S里博，F奥利维利，H米德尔，D莱曼，S拉沃尔德，
申请(专利权)人：米利波尔公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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