靶向基因扩增引物、高通量靶向测序文库及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种靶向基因扩增引物、高通量靶向测序文库及其制备方法。所述靶向基因扩增引物从5

【技术实现步骤摘要】
靶向基因扩增引物、高通量靶向测序文库及其制备方法


[0001]本专利技术涉及一种测序文库的制备方法，尤其涉及一种靶向基因扩增引物、高通量靶向测序文库及其制备方法与应用，属于生物检测


技术介绍

[0002]在精准医疗的背景推动下，靶向测序开始逐步推广，对于靶向测序来说，它能够在全基因组序列上获取与特定疾病相关的信息，这进一步推动了NGS测序的无效成本的降低以及增强了目的序列的测序深度。但是对于常用平台的测序的序列长度是一定的，在复杂的文库制备流程中，尤其是在靶向扩增过程中，加入一种或者多种引物会导致许多非特异性二聚体序列的产生，这些非特异性二聚体不仅增加了测序的无效成本，而且使得基因组的有效信息获取比例也降低了许多。

技术实现思路

[0003]本专利技术的主要目的在于提供一种包含II型限制性内切酶特异性识别位点的靶向基因扩增引物，以克服现有技术的不足。
[0004]本专利技术的另一目的在于提供一种高通量靶向测序文库及其制备方法。
[0005]为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：
[0006]本专利技术实施例提供了一种靶向基因扩增引物，它从5
’
端至3
’
端依次包括II型限制性内切酶特异性识别位点和根据目标基因位点设计的特异性引物序列。
[0007]本专利技术实施例还提供了一种高通量靶向测序文库的制备方法，其包括：
[0008]提供前述的靶向基因扩增引物；
[0009]采用所述靶向基因扩增引物对目标基因位点进行靶向扩增；
[0010]采用II型限制性内切酶对非特异性扩增产物及目标产物的引物部分进行切割，之后将切割后产物的粘性末端修补成平末端，之后进行磁珠纯化；
[0011]连接测序接头，经磁珠纯化后得到高通量靶向测序文库。
[0012]进一步的，所述II型限制性内切酶的切割位点位于识别位点序列以外不小于10bp的序列位置。
[0013]本专利技术实施例还提供了由前述方法获得的高通量靶向测序文库。
[0014]本专利技术实施例还提供了一种测序方法，其包括：采用前述方法制备高通量靶向测序文库，之后进行测序分析。
[0015]较之现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0016]本专利技术提供的高通量靶向测序文库的制备方法通过设计包含II型限制性内切酶特异性识别位点的引物序列，对目标位点进行靶向扩增后，之后通过限制性内切酶将非特异性二聚体引物切除，有效减少了非特异性二聚体序列的存在，从而提升了测序文库的质量，降低了测序误差，有助于增加有效测序信息获取的比例以及靶向基因测序的深度，使得疾病筛查更加准确。
附图说明
[0017]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0018]图1是本专利技术一典型实施例中一种靶向高通量测序文库的制备方法原理示意图；
[0019]图2是本专利技术一实施例中最终文库纯化后进行Agilent 4150的检测结果图。
具体实施方式
[0020]鉴于现有技术的不足，本案专利技术人经长期研究和大量实践，得以提出本专利技术的技术方案，主要是提供一种高通量靶向测序文库的制备方法，能够有效减少非特异性二聚体序列的存在，从而提升测序文库的质量，降低测序误差。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
[0021]本专利技术实施例的一个方面提供的一种靶向基因扩增引物，它从5
’
端至3
’
端依次包括II型限制性内切酶特异性识别位点和根据目标基因位点设计的特异性引物序列。
[0022]在一些实施例中，所述靶向基因包括TP53、SOX2、NOTCH1、ZNF750、CCND1等中的任一种。
[0023]在一些实施例中，所述II型限制性内切酶的种类包括AcuI、BpmI、BpuEI、BsgI、BtgZI等中的任一种，酶的浓度为5000units/ml。
[0024]在一些实施例中，所述II型限制性内切酶特异性识别位点由6个碱基组成。
[0025]在一些实施例中，所述靶向基因扩增引物的序列设计为：5'
‑
NNNNNN(MMMM)
n
‑
3'，NNNNNN为II型限制性内切酶的特异性识别序列；(MMMM)
n
为目标基因位点设计的扩增引物序列，n为18bp
‑
25bp。
[0026]进一步地，所述靶向基因扩增引物的特异性序列是根据目标基因位点设计的扩增引物。NNNNNN确定的前提下，(MMMM)
n
可根据需求设计成一个目标基因位点或者多个目标基因位点的扩增引物组成的混合物，引物浓度为4
‑
7μM。
[0027]其中，当II型限制性内切酶为AcuI时，靶向上游引物、靶向下游引物序列中对应的所述II型限制性内切酶特异性识别位点的序列分别如SEQ ID NO:1(CTGAAG)、SEQ ID NO:2(GACTTC)所示。
[0028]进一步地，当靶向基因为TP53时，所述靶向上游引物、靶向下游引物的序列分别如SEQ ID NO:3(CTGAAGACGACAGGGCTGGTTGC)、SEQ ID NO:4(GACTTCATAGGGCACCACCACACTATG)所示。
[0029]进一步地，当靶向基因为SOX2时，所述靶向上游引物、靶向下游引物的序列分别如SEQ ID NO:5(CTGAAGCGCCCGCATGTACAACAT)、SEQ ID NO:6(GACTTCACCACACCATGAAGGCATTCA)所示。
[0030]进一步地，当靶向基因为NOTCH1时，所述靶向上游引物、靶向下游引物的序列分别如SEQ ID NO:7(CTGAAGTGAGCACCCCTTCCTCAC)、SEQ ID NO:8(GACTTCCGCGCCGTTTACTTGAAG)所示。
[0031]进一步地，当靶向基因为ZNF750时，所述靶向上游引物、靶向下游引物的序列分别
如SEQ ID NO:9(CTGAAGCCTTCCAGTCCGGACGAC)、SEQ ID NO:10(GACTTCCCGAGAGATTGAGTGGAAGGTC)所示。
[0032]进一步地，当靶向基因为CCND1时，所述靶向上游引物、靶向下游引物的序列分别如SEQ ID NO:11(CTGAAGTCTCAGGACTGCCTCCGG)、SEQ ID NO:12(GACTTCGTCCCGCACGTCGGTG)所示。
[0033]在一些实施例中，当II型限制性内切酶为BpmI时，靶向上游引物、靶向下游引物序列中对应的所述II型限制性内切酶特异性识别位点的序列分别如本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向基因扩增引物，其特征在于，从5
’
端至3
’
端依次包括II型限制性内切酶特异性识别位点和根据目标基因位点设计的特异性引物序列。2.根据权利要求1所述的靶向基因扩增引物，其特征在于：所述II型限制性内切酶的种类包括AcuI、BpmI、BpuEI、BsgI、BtgZI中的任一种。3.根据权利要求2所述的靶向基因扩增引物，其特征在于：所述靶向基因包括TP53、SOX2、NOTCH1、ZNF750、CCND1中的任一种。4.根据权利要求3所述的靶向基因扩增引物，其特征在于：所述II型限制性内切酶特异性识别位点由6个碱基组成，当II型限制性内切酶为AcuI时，靶向上游引物、靶向下游引物序列中对应的所述II型限制性内切酶特异性识别位点的序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示；优选的，当靶向基因为TP53时，所述靶向上游引物、靶向下游引物的序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示；优选的，当靶向基因为SOX2时，所述靶向上游引物、靶向下游引物的序列分别如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示；优选的，当靶向基因为NOTCH1时，所述靶向上游引物、靶向下游引物的序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示；优选的，当靶向基因为ZNF750时，所述靶向上游引物、靶向下游引物的序列分别如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10所示；优选的，当靶向基因为CCND1时，所述靶向上游引物、靶向下游引物的序列分别如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示。5.根据权利要求2所述的靶向基因扩增引物，其特征在于：当II型限制性内切酶为BpmI时，靶向上游引物、靶向下游引物序列中对应的所述II型限制性内切酶特异性识别位点的序列分别如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示；和/或，当II型限制性内切酶为BpuEI时，靶向上游引物、靶向下游引物序列中对应的所述II型限制性内切酶特异性识别位点的序列分别如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16所示；和...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑建萍，蔺元斌，
申请(专利权)人：中国科学院宁波材料技术与工程研究所，
类型：发明
国别省市：